int(0)

Teste de laborator

Pachete de analize medicale

Planșa anatomică

Teste de la A la Z A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z
Teste Laborator
Product categories
Pachete analize Plansa anatomica
< inapoi la lista

Imunofenotipare limfocitară-infecții cronice

Pret 5080.00 MDL

Многие вирусные инфекции сохраняются неопределенно долго после острой фазы и могут иметь значительные клинические последствия. К ним относятся инфекции HBV, HCV, ВИЧ и HTLV, для которых характерны повышенные уровни постоянных антигенов, нарушение локализации иммунных клеток в тканях и нарушение функции клеток T 5.
По определению, постоянные вирусные инфекции не полностью контролируются иммунной системой хозяина. Измененная функция Т-клеток является иерархической и, по-видимому, напрямую коррелирует с антигенным уровнем; включает низкую выработку цитокинов и нарушенную пролиферативную способность до полного «истощения» Т-клеток, участвующих в иммунном ответе. Это явление контрастирует с нормальным развитием Т-клеток памяти, которые происходят в отсутствие постоянного антигена 2; 5.
Процесс «истощения» Т-клеток в результате непрерывной конфронтации с умеренными или повышенными уровнями вирусных антигенов, экспрессирующихся на многих клетках, первоначально был описан у мышей, инфицированных вирусом хориолимфоцитарного менингита, и было обнаружено, что он применим к инфекциям ВИЧ и ВГС. тот человек. До сих пор нет однозначного ответа на вопрос, является ли «истощение клеток» следствием постоянного воздействия высоких концентраций антигена или же оно является причиной неконтролируемой репликации вируса и, следовательно, увеличения антигенной нагрузки.
На молекулярном уровне «истощение» Т-клеток определяется:

• изменение сигнальных путей с помощью TCR и цитокинов;

• экспрессия ингибирующих рецепторов (PD-1, LAG-3, Tim3 и др.);

• метаболический и энергетический дефицит;

• изменение созревания / дифференциации 2.

Отсутствие IL-2-продуцирующих клеток при постоянном воздействии ВИЧ является особенно важным открытием в свете недавних исследований развития Т-клеток памяти. Таким образом, клетки памяти CD4 и CD8 можно разделить на два подтипа в соответствии с эффекторными функциями и способностью миграции: CD45RA- центральные T-клетки памяти, которые экспрессируют маркеры L-селектина (CD62L) и CCR7 и CD45RA эффекторные T-клетки памяти, которые не экспрессирует эти маркеры и не мигрирует в сайты репликации вируса в тканях. Что касается продукции цитокинов, Т-клетки центральной памяти продуцируют в основном IL-2, тогда как эффекторные T-клетки памяти продуцируют как IL-2, так и гамма-интерферон.

Постоянство антигена у ВИЧ-инфицированных лиц в фазе виремии связано с низким числом вирус-специфических центральных клеток памяти CD4 + по сравнению с индивидуумами с подавленной виремией. Аналогичные результаты были получены при хронической вирусной инфекции С. Эти исследования показывают, что хроническое воздействие антигена приводит к функциональному нарушению вирус-специфических клеток CD4. Таким образом, присутствие вирусного антигена стимулирует генерацию эффекторных клеток памяти, способных продуцировать гамма-интерферон, но обладающих сниженной пролиферативной способностью и короткой продолжительностью жизни in vivo; в то же время нарушается развитие клеток центральной памяти, которые обладают пролиферативной способностью и секретируют IL-2; в свою очередь, эффекторные клетки памяти снижают уровень антигена 1.
Исследования, описывающие функциональный дефект в вирус-специфических клетках CD4 +, могут объяснить отсутствие эффективной противовирусной функции клеток CD8 + при ВИЧ-инфекции. Для устойчивого ответа клеток CD8 + представляется необходимым, чтобы лимфоциты CD4 + обеспечивали IL-2 (на ранних стадиях хронической инфекции) и IL-21 (на поздних стадиях). Экспрессия костимулирующей молекулы CD28 + на поверхности антиген-специфических клеток CD8 +, возможно, связана с продукцией IL-2 клетками CD4 +. Другим способом, с помощью которого CD4 + T-клетки способствуют устойчивому ответу CD8 + клеток на персистирующие инфекции, является непрерывная индукция и поддержание продукции нейтрализующих антител 1; 2.
Основываясь на концепции, которая включает участие нескольких механизмов в снижении ответов CD8 + T-клеток при хронических вирусных инфекциях, появились новые возможности для иммуномодулирующих вмешательств, которые в настоящее время оцениваются.
В некоторых сообщениях задокументировано обратное изменение функции CD4 + T-клеток, выделенных от мышей, хронически инфицированных вирусом лимфоцитарного хориоменингита, от обезьян, инфицированных вирусом SIV, или от людей, инфицированных ВИЧ или HCV, путем блокирования одного или нескольких ингибиторных рецепторов. Это функциональное восстановление зависело от продолжительной культуры in vitro в присутствии соответствующих блокирующих антител и предшествовало пролиферации CD8 + T-клеток. Индукция пролиферации в присутствии блокирующих антител против PD-1 приводит к уменьшению апоптоза, а также к увеличению длины теломер и активности теломеразы, которые, по-видимому, способствуют увеличению пролиферативного потенциала и восстановлению эффекторных функций 2.
Иммунофенотипирование лимфоцитов – профиль хронических инфекций и рекомендации по выполнению этого теста
Профиль хронических инфекций включает следующие клетки, выраженные в процентах и ​​абсолютных значениях:

• количество лейкоцитов, гранулоцитов, лимфоцитов, моноцитов;

• общее количество Т-клеток (CD3 +);

• CD45RA + наивные Т-клетки, CD45RA- Т-клетки памяти;

• хелперные Т-клетки (CD4 +);

• наивные CD45RA + T-клетки, связанные с количеством CD4 + клеток;

• CD31 + Т-клетки;

• CD8 + T-клетки, CD8 + / CD28 + T-клетки (цитотоксические), CD8 + / CD28- T-клетки (регуляторы);

• соотношение CD4 + / CD8 +;

• незрелые Т-клетки (CD4 + / CD8 +);

• В-клетки (CD19 +);

• NK-клетки (CD16 + / CD56 +);

• активированные Т-клетки (CD3 + / HLA DR +).

Наблюдение за иммунофенотипической картиной лимфоцитов полезно при клиническом мониторинге пациентов с хроническими инфекциями в сочетании с назначенным лечением 3.
Материал – венозная кровь 3.
Транспортная среда, пробирка- вакуумный контейнер, содержащий ЭДТА в качестве антикоагулянта 3.
Объем образца – 5 мл крови 3.
Стабильность образца – кровь должна поступать в лабораторию, где проводится анализ не более 24 часов, и в течение этого периода она хранится при комнатной температуре. Охлаждение образца противопоказано3.
Причины отказа от пробы – образцы, которые превысили интервал стабильности, охлажденные или замороженные образцы 3.
Метод – проточная цитометрия 3.
Референтные значения и интерпретация результатов
Последний бюллетень будет содержать контрольные интервалы для подмножеств лимфоцитов, соответствующих возрасту пациента, а также интерпретацию полученных результатов 3.

Следует отметить, что на абсолютное количество популяций лимфоцитов влияет ряд биологических факторов, включая гормоны, температуру и окружающую среду. Исследования циркадных вариаций показали прогрессивное увеличение количества клеток CD4 + в течение дня, в то время как лимфоциты CD8 + и лимфоциты CD19 + B увеличиваются только в первой половине дня, без изменений в течение дня. По этой причине при выполнении последовательного мониторинга популяций лимфоцитов рекомендуется брать образцы крови в одно и то же время суток 4.
При хронических инфекциях обычно наблюдается гранулоцитопения, снижение лимфоцитов CD4 + и изменение соотношения CD4 / CD8.
Наивные CD4 + CD31 + T-клетки представляют собой субпопуляцию наивных CD4 + T-клеток, недавно высвободившихся из тимуса. Определение резерва тимуса с помощью наивных CD31 + T-клеток полезно для выявления причины персистирующей лимфопении. Это может быть связано с высоким «потреблением» (признаком хронической инфекции) или низким «производством». Чем выше доля CD31 + Т-клеток, тем больше способность генерировать наивные Т-лимфоциты.
Отношение наивных Т-клеток к Т-клеткам памяти уменьшается в течение жизни, так как новые ячейки памяти всегда генерируются при контакте с антигенами. При хронических инфекциях процент Т-клеток с памятью CD45RA увеличивается в результате хронической иммунной активации 3
Библиография
1. Cheryl L Day, Bruce D Walker. Progress in Defining CD4 Helper Cell Responses in Chronic Viral Infections. In J Exp Med, Vol. 198, No.12, December 2003.
2. Helge Frebel, Kirsten Richter, Annette Oxenius. How chronic viral infections impact on antigen-specific T-cell responses. In European Journal of Immunology, 2010.
3. Лаборатория Synevo. Конкретные ссылки на технологии работы использованы 2010. Ref Type: Catalog.
4. Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. T- and B-Cell Quantitation by Flow Cytometry. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
5. Scott N. Mueller, Barry T. Immune responses to viruses. In Clinical Immunology. Principles and Practice, Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 426-427.

Informaţii generale

Multe infecţii virale persistă indefinit după faza acută şi pot avea consecinţe clinice considerabile. Printre acestea se numără infecţiile HBV, HCV, HIV şi HTLV, ce sunt caracterizate prin niveluri crescute ale antigenelor persistente, prin afectarea localizării tisulare a celulelor imune şi perturbarea funcţiei celulelor T5.

Prin definiţie, infecţiile virale persistente nu sunt controlate în întregime de sistemul imun al gazdei. Funcţia alterată a celulelor T este ierarhică şi pare să se coreleze direct cu nivelul antigenic; include o producţie scăzută de citokine şi o capacitate proliferativă perturbată, până la “epuizarea” completă a celulelor T implicate în răspunsul imun. Acest fenomen contrastează cu dezvoltarea normală a celulelor T cu memorie care se produce în absenţa antigenului persistent2;5.

Procesul de “epuizare” a celulelor T, ca urmare a confruntării continue cu niveluri moderate sau crescute de antigene virale exprimate pe numeroase celule, a fost descris iniţial la şoarecii infectaţi cu virusul meningitei coriolimfocitare şi s-a constatat că se aplică şi la infecţiile HIV şi HCV la om. Până în acest moment, nu există un răspuns definit la întrebarea dacă “epuizarea” celulelor T este consecinţa expunerii continue la concentraţii crescute de antigen sau aceasta constituie cauza replicării virale necontrolate şi deci a încărcării antigenice crescute.

La nivel molecular, “epuizarea” celulelor T este definită prin:

• alterarea căilor de semnalizare prin TCR şi citokine;
• exprimarea de receptori inhibitori (PD-1, LAG-3, Tim3 etc.);
• deficit metabolic şi energetic;
• alterarea maturaţiei/diferenţierii2.

Lipsa celulelor producătoare de IL-2 în cursul expunerii persistente la virusul HIV este o constatare deosebit de importantă în lumina studiilor recente privind dezvoltarea celulelor T cu memorie. Astfel, celulele de memorie CD4 şi CD8 pot fi împărţite în două subtipuri, după funcţiile efectoare şi capacitatea de migrare: celule T de memorie centrale CD45RA – care exprimă markerii L-selectin (CD62L) şi CCR7 şi celule T de memorie efectoare CD45RA – care nu exprimă aceşti markeri şi care migrează către situsurile replicării virale din ţesuturi. In ceea ce priveşte producţia de citokine, celulele T de memorie centrale produc în principal IL-2, în timp ce celulele T de memorie efectoare produc atât IL-2 cat şi interferon gamma.

Persistenţa antigenului la persoanele infectate cu HIV în faza de viremie este asociată cu un număr scăzut de celule CD4+ de memorie centrale virus-specifice în comparaţie cu persoanele ce au o viremie suprimată. Constatări similare au fost raportate şi în infecţia cronică cu virus C. Aceste studii arată că expunerea cronică la antigen conduce la alterarea funcţională a celulelor CD4 virus-specifice. Astfel, prezenţa antigenului viral stimulează generarea de celule de memorie efectoare capabile să producă interferon gamma, dar care au o capacitate de proliferare redusă şi o durată de viaţă scurtă in vivo; în acelaşi timp este perturbată dezvoltarea de celule de memorie centrale care au capacitate proliferativă şi secretă IL-2; la rândul lor, celulele de memorie efectoare scad nivelurile de antigen1.

Studiile care descriu un defect funcţional în celulele CD4+ virus-specifice ar putea explica lipsa funcţiei antivirale eficace a celulelor CD8+ in infecţia HIV. Pentru un răspuns susţinut al celulelor CD8+ se pare că este necesar ca limfocitele CD4+ să furnizeze IL-2 (în cursul fazelor precoce ale infecţiei cronice) şi IL-21 (în cursul fazelor tardive). Exprimarea moleculei costimulatoare CD28 pe suprafaţa celulelor CD8+ antigen-specifice este posibil legată de producţia de IL-2 de către celulele CD4+. O altă modalitate prin care celulele T CD4+ contribuie la răspunsul susţinut al celulelor CD8+ în cazul infecţiilor persistente este inducţia continuă şi menţinerea producţiei de anticorpi neutralizanţi1;2.

Pe baza conceptului care prevede implicarea mai multor mecanisme în reducerea răspunsurilor celulelor T CD8+ în cursul infecţiilor virale cronice, au apărut posibilităţi noi de intervenţii imunomodulatoare care se află în curs de evaluare.

Unele comunicări au documentat reversarea in vitro a funcţiei celulelor T CD4+ izolate de la şoarecii infectaţi cronic cu virusul coriomeningitei limfocitare, de la maimuţele infectate cu virusul SIV sau de la oamenii infectaţi cu HIV sau HCV, prin blocarea unuia sau mai multor receptori inhibitori. Această restaurare funcţională a fost dependentă de cultura in vitro prelungită în prezenţa anticorpilor blocanţi respectivi şi a fost precedată de proliferarea celulelor T CD8+. Inducţia proliferării în prezenţa anticorpilor blocanţi îndreptaţi împotriva PD-1 rezultă într-o apoptoză redusă precum şi într-o creştere atât a lungimii telomerelor cât şi a activităţii telomerazei, ambele contribuind, se pare, la potenţialul proliferativ crescut şi la recuperarea funcţiilor efectoare2.

Imunofenotipare limfocitară – profil infecţii cronice şi recomandări pentru efectuarea acestui test

Profilul infecţii cronice cuprinde următoarele celule exprimate în valoare procentuală şi absolută:

• numărul de leucocite, granulocite, limfocite, monocite;
• numărul total de celule T(CD3+);
• celulele T naive CD45RA+, celulele T de memorie CD45RA- ;
• celule T helper (CD4+);
• celulele T naive CD45RA+ raportate la numărul de celule CD4+;
• celule T CD31+;
• celule T CD8+, celule T CD8+/CD28+ (citotoxice), celule T CD8+/CD28- (reglatoare);
• raport CD4+/CD8+;
• celule T imature (CD4+/CD8+);
• celule B ( CD19+);
• celule NK (CD16+/CD56+);
• celule T activate (CD3+/HLA DR+).

Urmărirea tabloului imunofenotipal limfocitar este util în monitorizarea clinică a pacienţilor cu infecţii cronice în corelaţie cu tratamentul administrat3.

Specimen recoltat – sânge venos3. 

Recipient de recoltare – vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant3.

Volum probă – 5 mL sânge3.

Stabilitate probă – sângele trebuie să ajungă în maxim 24 ore la laboratorul la care se efectuează testul şi în această perioadă se păstrează la temperatura camerei. Este contraindicată refrigerarea probei3.

Cauze de respingere a probei – specimene care au depăşit intervalul de stabilitate, probe refrigerate sau congelate3.

Metodăcitometrie în flux3.

Valori de referinţă şi comunicarea rezultatelor

Buletinul final va conţine intervalele de referinţă pentru subseturile limfocitare adecvate vârstei pacientului  împreună cu o interpretare a rezultatelor obţinute3

Trebuie cunoscut faptul că numărul absolut al populaţiilor limfocitare este influenţat de o serie de factori biologici, inclusiv hormoni, temperatură şi mediul înconjurător. Studiile legate de variaţiile circadiane au demonstrat o creştere progresivă a numărului de celule CD4+ în cursul zilei, în timp ce limfocitele CD8+ şi limfocitele B CD19+ cresc doar în prima parte a zilei, fără a se modifica în cursul după-amiezei. Din acest motiv, atunci când se efectuează o monitorizare seriată a populaţiilor limfocitare se recomandă ca probele de sânge să se recolteze în acelaşi moment al zilei4.

În infecţiile cronice se înregistrează de obicei o granulocitopenie, o reducere a limfocitelor CD4+ şi o inversare a raportului CD4/CD8.

Celulele T naive CD4+CD31+  reprezintă o subpopulaţie a celulelor T CD4+ naive recent eliberate din timus. Determinarea rezervei timice prin celule T naive CD31+ este utilă în depistarea cauzei unei limfopenii persistente. Aceasta poate fi datorată unui “consum”crescut (indiciu de infecţie cronică) sau unei “producţii” scăzute. Cu cât proporţia de celule T CD31+ este mai mare cu atât capacitatea de generare a limfocitelor T naive este mai mare.

Raportul dintre celulele T naive şi celulele T cu memorie scade în cursul vieţii, deoarece se generează mereu noi celule cu memorie prin contactul cu antigenele. In infecţiile cronice apare creşterea procentuală a celulelor T cu memorie CD45RA- ca urmare a activării imune cronice3.

 

Bibliografie

1. Cheryl L Day, Bruce D Walker. Progress in Defining CD4 Helper Cell Responses in Chronic Viral Infections. In J Exp Med, Vol. 198, No.12, December 2003.
2. Helge Frebel, Kirsten Richter, Annette Oxenius. How chronic viral infections impact on antigen-specific T-cell responses. In European Journal of Immunology, 2010.
3. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.
4. Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. T- and B-Cell Quantitation by Flow Cytometry. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
5. Scott N. Mueller, Barry T. Immune responses to viruses. In Clinical Immunology. Principles and Practice, Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 426-427.
< inapoi la lista

Pret 5080.00 MDL