Acasa

Informaţii generale

Hemoleucograma completă (analiza generală a sângelui) constă din măsurarea următorilor parametrii:

Hemograma este un test screening de bază, fiind unul din cele mai frecvent cerute teste de laborator, reprezentând adesea primul pas in stabilirea statusului hematologic şi diagnosticul diverselor afectiuni hematologice şi nehematologice. Cuantificarea parametrilor hematologici asociată uneori cu examinarea frotiului de sânge aduce informaţii preţioase, orientând in continuare spre efectuarea altor teste specifice⁹.

Pregătire pacient

Hemograma se poate recolta à jeun (pe nemâncate) sau postprandial (trebuie totuşi evitate mesele bogate in lipide care pot interfera cu anumiţi parametri ai hemogramei).

Sexul, vârsta pacientului, precum şi anumite condiţii cum ar fi: starea de şoc, varsături incoercibile, administrarea masivă de lichide i.v. etc., care pot duce la deshidratarea, respectiv hiperhidratarea pacientului, precum şi anumite tratamente urmate de pacient trebuie comunicate laboratorului.

Este de preferat evitarea pe cât posibil a stresului in momentul recoltarii.

In cazul monitorizării regulate (zilnic sau la două zile) a anumitor parametrii, proba de sânge pentru efectuarea hemogramei trebuie obţinută în acelaşi moment al zilei (datorită fluctuaţiilor fiziologice circadiene ale unor parametri) ^4;6;9;19.

Specimen recoltat, recipient şi cantitate recoltată – sânge venos recoltat pe anticoagulant: EDTA tripotassium/dipotasium/disodium (vacutainer cu capac mov/roz – K3 EDTA); la copii mici se poate recolta sânge capilar din deget/călcâi pe heparină (microtainer).

Se amestecă continuţul prin inversiunea uşoară a tubului de circa 10 ori.

Tubul trebuie să fie umplut cel puţin trei sferturi pentru ca raportul sânge/anticoagulant să fie optim (concentraţia recomandată de EDTA este de 1.2 – 2.0 mg/mL de sânge) ^4;6;9;19.

Cauze de respingere a probei

Prelucrare necesară după recoltare – dacă proba nu este trimisă imediat la laborator trebuie refrigerată⁹.

Stabilitate probă – 36-48 ore la temperatura camerei (18-26°C) sau la frigider (2–8°C) – pentru determinarea hemoglobinei şi numărătorilor de celule. Este recomandat ca probele să fie analizate în primele 6 ore de la recoltare. Nu se recomandă depăşirea acestui interval pentru determinarea indicilor eritrocitari şi hematocritului. Dacă proba a fost refrigerată, trebuie echilibrată la temperatura camerei inainte de a fi analizată⁹.

Metodă de determinare – analizor automat pe principiul citometriei in flux cu fluorescenta utilizând LASER semiconductor şi focusare hidrodinamică⁹.

Numărul de eritrocite (numărul de celule roşii)

Numărul de eritrocite reprezintă testul de bază pentru evaluarea eritropoiezei. Eritrocitele sunt investigate în continuare prin măsurarea concentraţiei de hemoglobină şi a hematocritului, iar pe baza lor analizorul calculează indicii eritrocitari: VEM, HEM, CHEM şi RDW, care caracterizează, din punct de vedere calitativ, populaţia eritrocitară.

Eritrocitele sunt cele mai numeroase celule din sânge, sunt anucleate, fiind necesare pentru respiraţia tisulară. Eritrocitele sunt cele mai specializate celule ale organismului, principala funcţie constând în transportul 0₂ de la plămân la ţesuturi şi transferul CO₂ de la ţesuturi la plămân. Acest lucru se realizează prin intermediul hemoglobinei conţinute în eritrocite. Forma eritrocitelor de disc biconcav conferă raportul volum/suprafaţă optim pentru schimbul de gaze şi le asigură acestora deformabilitatea în timpul traversării microcirculaţiei.

Indicaţii – în combinaţie cu hematocritul şi concentraţia de hemoglobină, numărul de eritrocite este util în detectarea şi monitorizarea anemiei şi eritrocitozei/policitemiei.

Metodă de determinare – eritrocitele sunt numărate de analizorul automat în timpul trecerii acestora printr-un orificiu prin care sunt dirijate într-un singur rând prin metoda de focusare hidrodinamică^{4;6-8;9;14;16;19}.

Valori de referinţă – valori diferite în funcţie de vârstă şi sex (vezi anexa 7.1.1); se exprimă în număr de eritrocite x10⁶/μL (mm³) sau număr de eritrocite x10¹²/L⁹.

Semnificaţie clinică

Numărul de eritrocite ca singur parametru are valoare diagnostică mică; o evaluare corectă a masei de eritrocite a organismului poate fi obţinută doar în corelaţie cu hematocritul. Numărul de eritrocite este influenţat de modificările volumului plasmatic, ca de exemplu în sarcină sau în tulburări ale echilibrului hidro-electrolitic^4;6;14.

1. Scăderea numărului de eritrocite: determină anemie. Anemia este definită din punct de vedere funcţional printr-o masă eritrocitară insuficientă pentru asigurarea unei cantităţi adecvate de oxigen ţesuturilor periferice. In practică, se consideră anemie atunci când concentraţia de hemoglobină, hematocritul şi/sau numărul de eritrocite sunt sub valorile de referinţă⁷. Diagnosticul este dificil dacă doar unul din parametri este sub valorile limită; în acest caz hemograma trebuie monitorizată în continuare pentru stabilirea unui diagnostic corect.

In anemia acută datorată hemoragiei, numărul de eritrocite şi concentraţia de hemoglobină rămân nemodificate în primele ore datorită pierderii concomitente de plasmă; ele încep să scadă pe măsură ce se produce corecţia deficitului volumic.

In anemiile cronice volumul sanguin este aproape normal prin creşterea compensatorie a volumului plasmatic, iar numărul de eritrocite şi hematocritul sunt de obicei scăzute. Totuşi, în condiţiile asociate cu microcitoza marcată (anemie feriprivă severă, talasemie), numărul de eritrocite poate rămâne în limite normale sau poate fi chiar crescut.

Anemia relativă este o condiţie caracterizată prin masa normală de eritrocite, dar cu volum sanguin crescut prin creşterea volumului plasmatic, ca de exemplu în sarcină, splenomegalie masivă. In această situaţie proteinele totale plasmatice sunt la limita inferioară a normalului, spre deosebire de anemia cronică în care proteinele totale sunt în limite normale¹⁹.

Pentru a identifica cauza anemiei, informaţiile privind istoricul bolii şi examinarea fizică trebuie integrate cu câteva teste de laborator cheie, cum ar fi determinarea numărului de reticulocite, indicilor eritrocitari, examinarea frotiului de sânge colorat şi eventual a măduvei osoase. Prezenţa altor anomalii hematologice (trombocitopenie, anomalii ale leucocitelor) orientează diagnosticul spre o posibilă insuficienţă medulară datorată anemiei aplastice, unei boli hematologice maligne sau dislocării măduvei osoase prin procese patologice de cauza extrahematologică. Pancitopenia poate apărea şi ca urmare a distrucţiei periferice sau sechestrării celulare prin hipersplenism.

2. Creşterea numărului de eritrocite (concentraţiei de hemoglobină şi/sau hematocritului) determină eritrocitoza. Eritrocitoza poate fi rezultatul creşterii masei eritrocitare totale (policitemie/eritrocitoza absoluta) ori poate fi consecinţa reducerii volumului plasmatic (eritrocitoza relativă/falsă)¹⁴.

Clasificarea eritrocitozei¹⁴

A. Eritrocitoza/policitemie relativă (peudoeritrocitoza): hemoconcentratie; sindromul Gaisbőck.

B. Policitemie (eritrocitoză absolută)

Policitemie primară: policitemia vera; policitemia primară familială Policitemie secundară:

3. Policitemie idiopatică.

Interferenţe ^4;6;8;16;19

1. Recoltarea cu pacientul in poziţie culcată determină scăderea numărului de eritrocite (şi hematocritului) cu 5 – 10% (prin redistribuirea lichidului din spaţiul interstiţial spre circulaţie datorită modificării presiunii hidrostatice la nivelul membrelor inferioare).

2. Stresul poate determina creşterea numărului de eritrocite.

3. Staza venoasă prelungită >2 minute in timpul venopuncţiei determină creşterea numărului de eritrocite cu ~10% (şi creşterea semnificativă a hematocritului). De asemenea, recoltarea după efort fizic intens determină creşterea numărului de eritrocite cu până la 10% (ca şi creşterea concentraţiei de hemoglobină). Toate acestea se datorează hemoconcentraţiei.

4. Deshidratarea cu hemoconcentraţie consecutivă (şoc, arsuri severe, obstrucţie intestinală, vărsături/diaree persistente, abuz de diuretice) poate masca prezenţa anemiei. De asemenea, hiperhidratarea pacientului (administrarea masivă de lichide i.v.) poate determina niveluri fals scăzute ale numărului de eritrocite.

5. Prezenţa aglutininelor la rece in titru mare determină, dacă sângele este păstrat la temperatura camerei, niveluri fals scăzute ale numărului de eritrocite şiun VEM fals crescut; în consecinţă hematocritul este fals scăzut, iar HEM şi CHEM sunt crescute.

6. Prezenţa de crioglobuline în concentraţie mare poate interfera cu determinarea numărului de eritrocite.

7. Trombocitele mari/macrotrombocitele (ex.: din trombocitemia esenţială) pot fi numărate ca eritrocite.

8. Numeroase medicamente pot determina creşterea sau scăderea numărului de eritrocite:

Hematocritul măsoară raportul dintre volumul ocupat de eritrocite şi volumul sanguin total.

Indicaţii – detectarea şi monitorizarea anemiei şi policitemiei.

Metoda de determinare – analizorul automat calculează hematocritul prin determinarea numărului de eritrocite/L de sange şi măsurarea amplitudinii impulsurilor in eritrocite prin metoda luminii dispersate⁹.

Valori de referinţă – diferite în funcţie de vârstă şi sex (vezi anexa 7.1.1). Hematocritul se exprimă ca fracţie decimală/ca procent⁹.

Semnificaţie clinică

Hematocritul depinde de masa eritrocitară, volumul eritrocitar mediu şi volumul plasmatic.

De obicei, atunci cand hematiile sunt de mărime normală, modificările hematocritului le urmează pe cele ale numărului de eritrocite. Totuşi în anemia micro-/macrocitară relaţia poate să nu se păstreze. De exemplu, în talasemie hematocritul scade deoarece hematiile microcitare ocupă un volum mai mic, în timp ce numărul de eritrocite poate fi normal/crescut^8;16.

1. Scăderea hematocritului:

– anemie; la un Hct <30% (0.30) un pacient este moderat – sever anemic

– creşterea volumului plasmatic (sarcină)

2. Creşterea hematocritului:

– eritrocitoză/policitemie

– hemoconcentratie (ex.: şoc; aport insuficient de lichide: copii mici, varstnici; poliurie etc.)⁸

Valori critice -un Hct <20% poate determina insuficienţă cardiacă şi deces

                             -un Hct >60% se asociază cu coagularea spontană a sângelui⁶

Interferenţe

1. Excesul de anticoagulant (cantitate insuficientă de sânge) determină scăderea volumului eritrocitar şi în consecinţă scăderea Hct determinat manual (efect mai pronunţat pentru K3-EDTA decât pentru K2-EDTA).

2. In sângele arterial Hct este cu ~2% mai mare decât în sângele venos.

3. In reticulocitoză, leucocitoză marcată, prezenţa de crioglobuline sau macrotrombocite analizorul automat poate determina valori fals crescute ale Hct (volumele mai mari ale reticulocitelor şi leucocitelor intră in calculul Hct).

4. Valori fals scăzute ale Hct pot apărea în cazuri de hemoliza in vitro, autoaglutinare, microcitoză^4;6;8;16;19.

Hemoglobina

Hemoglobina reprezintă componentul principal al eritrocitelor (95% din proteinele citoplasmatice eritrocitare) şi serveşte ca vehicul pentru transportul O₂ şi CO₂. Hemoglobina este o proteină conjugată constând dintr-un tetramer format din 2 perechi de lanţuri polipeptidice (globine), fiecare dintre acestea fiind conjugat cu un grup hem, un complex al unui ion de fier cu pigmentul roşu, porfirina, care conferă sângelui culoarea roşie. Fiecare gram de hemoglobină poate transporta 1.34 mL O₂ per 100 mL de sânge.

Hemoglobina serveşte de asemenea ca tampon în lichidul extracelular. In tesuturi, la pH scăzut, O₂ se disociază de Hb; Hb deoxigenată se leagă de ionii de hidrogen; în eritrocite anhidraza carbonică converteşte CO₂ în bicarbonat şi ioni de hidrogen. Pe măsura ce ionii de hidrogen se leagă de hemoglobină, ionii bicarbonat părăsesc celula; pentru fiecare ion bicarbonat care părăseşte celula intră un ion de clor⁶.

Formele de hemoglobină prezente în mod normal în circulaţie includ: deoxihemoglobina (HHb), oxihemoglobina (O₂Hb), carboxihemoglobina (COHb) şi methemoglobina (MetHb), toate acestea fiind determinate împreună în sângele total. In anumite situaţii clinice diferitele forme de Hb pot fi determinate individual¹⁹.

Indicatii – împreună cu Hct şi numărul de eritrocite, este utilă pentru detectarea şi monitorizarea anemiei şi policitemiei.

Metoda de determinare – Hb este determinată automat prin metoda fotometrică în urma conversiei în SLS-Hb cu ajutorul unui surfactant Sodium Lauryl Sulfate⁹.

Valori de referintă – diferite în funcţie de vârstă şi sex (vezi anexa 7.1.1). Hb se exprimă în g/L sau g/dL. In cazul exprimării ca şi concentraţie în mmol/L se utilizează următorii factori de conversie¹⁹:

mmol/L = g/L x 0.0621

mmol/L = g/dL x 0.621

g/dL= mmol/L x 1.61

g/L= mmol/L x 16.1

Numărul de eritrocite, Hb şi Hct pot fi analizate aplicand “regula lui trei”⁴: dacă eritrocitele sunt normocitare/normocrome: nr. Er x3 ~ valoarea Hb.

Hematocritul poate fi estimat din hemoglobină utilizand următoarea formula:

Hct = Hb (g/dL) x 2.8 + 0.8 sau Hct = Hb x 3

Dacă există o deviere semnificativă de la această regulă trebuie verificată existenta de anomalii ale indicilor eritrocitari şi aspectul frotiului de sange⁹.

Semnificatie clinică

1.Scăderea hemoglobinei sub nivelurile de referintă determină aparitia anemiei. Hb trebuie evaluată impreună cu Hct, numărul de eritrocite, indicii eritrocitari şi morfologia celulară pe frotiu pentru clasificarea anemiei. O valoare normală a concentratiei de Hb nu exclude anemia datorată hemoragiei acute.

In sarcină concentratia de hemoglobină scade cu 2–3 g/dL datorită unei creşteri disproportionate a volumului plasmatic fată de masa eritrocitară¹⁹.

La nou-născut masa eritrocitară este mai mare la naştere decat la adult şi scade continuu in prima săptămană de viată, Hb putand ajunge pană la 9 g/dL in săptămanile 11–12 de viată (anemie fiziologică). Scăderea apare mai precoce şi este mai pronuntată la prematuri. Nivelurile de la adult sunt atinse in jurul varstei de 14 ani; la varstnici apare o scădere graduală a concentratiei de hemoglobină.

2. Creşterea hemoglobinei apare in eritrocitoză/policitemie. După convietuirea un timp indelungat la altitudine survine o creştere a Hb corespunzătoare la 1 g/dL pentru 2000 m.

Valori critice – la Hb <5g/dL apare insuficienta cardiacă şi poate surveni decesul;

                             – o concentratie de Hb >20 g/dL poate duce la blocarea capilarelor ca urmare a hemoconcentratiei⁶.

Interferente

1. Turbiditatea serului datorată hiperlipemiei (hipertrigliceridemiei), leucocitozei >50000/μL, trombocitozei >700000/μL sau hiperproteinemiei determină valori fals crescute ale hemoglobinei.

2. Prezenta de crioglobuline in concentratie mare poate afecta determinarea Hb (prin fenomenul de floculare).

3. Efortul fizic intens poate determina creşterea Hb.

4. Interferente medicamentoase⁶

-numeroase medicamente pot scădea Hb;

-pot creste Hb: gentamicina, methyldopa^4;6;8;16;19.

Indici Eritrocitari

Evaluarea eritrocitelor din punct de vedere al volumului şi continutului in hemoglobină se realizează prin măsurarea sau calcularea următorilor parametrii:

Volumul eritrocitar mediu (VEM) – reprezintă volumul ocupat de un singur eritrocit.

Metoda de determinare – VEM este calculat după următoarea formulă:

                 Hct (%) x 10

VEM =    ——————–

                Nr.Er.(x10⁶/μL)

VEM este determinat prin impărtirea sumei volumelor eritrocitare la numărul de eritrocite⁹.

Valori de referintă – VEM se exprimă in micrometri cubi sau femtolitri (fL). La adult este cuprins intre 80 – 100 fL (valori mai mari la nou-născuti, precum şi la varstnici; valori mai mici la copii pană la 18 ani – vezi anexa 7.1.1)⁹.

Semnificatie clinică

VEM este un indice util pentru clasificarea anemiilor şi poate sugera mecanismul fiziopatologic al afectării eritrocitare. Impreună cu ceilalti indici eritrocitari, poate permite detectarea precoce a unor procese care vor cauza anemie. VEM depinde de osmolaritatea plasmatică şi numărul diviziunilor eritrocitare.

1. VEM normal: anemie normocitară (dacă se asociază cu RDW <15).

Clasificarea anemiilor normocitare

 I. Anemie asociată cu răspuns eritropoietic adecvat:

II. Anemie asociată cu secretie scăzută de eritropoietină:

III. Anemie asociată cu răspuns medular inadecvat:

2. VEM scăzut (<80 fL): anemie microcitară. Majoritatea anemiilor microcitare se datorează sintezei deficitare de hemoglobină, adesea asociată cu deficitul de fier sau cu alterarea utilizării fierului, precum şi cu unele conditii ereditare. Datorită acestei deficiente precursorii eritroizi parcurg mai multe diviziuni decat in mod normal, ducand la formarea de eritrocite mature de dimensiuni mai mici. RDW este >15^7;19.

Clasificarea anemiilor microcitare

I. Afectiuni ale metabolismului fierului:

II. Boli ale sintezei moleculelor de globină:

III. Boli ale sintezei de hem şi porfirină:

Cea mai frecventă cauză este deficitul de fier, anemia feriprivă fiind cea mai intalnită formă de anemie de pe glob⁷.

3. VEM crescut (>100 fL): anemia macrocitară. Pe baza criteriilor biochimice şi morfologice anemiile macrocitare se pot imparti in două grupuri: anemii megaloblastice şi non-megaloblastice³.

In anemiile megaloblastice³ marca morfologică este reprezentată de prezenta precursorilor eritroizi anormali in măduva osoasă, caracterizati prin dimensiuni crescute şi alterări specifice in aspectul cromatinei nucleare. Aceste celule distincte reprezintă expresia morfologică a unei anomalii biochimice, respectiv intarzierea sintezei de ADN. Rata sintezei hemoglobinei, respectiv sinteza ARN, nu este afectată in timp ce rata diviziunilor celulare este redusă, in consecintă componentele citoplasmatice, in special Hb sunt sintetizate in exces in timpul intarzierii intre diviziunile celulare, ducand la formarea unor eritrocite de dimensiuni crescute. Cele două modificări caracteristice de pe frotiul de sange care permit diferentierea anemiilor megaloblastice sunt prezenta macroovalocitelor şi a neutrofilelor cu nucleu hipersegmentat. In anemia megaloblastică VEM este de obicei >110 fL (110 – 130 fL, chiar pană la 160 fL).

Clasificarea patogenică a anemiilor megaloblastice

I. Deficitul de vitamină B12

A. Dieta deficitară (rară: vegetarianismul strict, de lungă durată, fără ouă şi produse lactate; mai frecventă la copiii născuti din mame strict vegetariene sau la cei cu diete restrictive in fenilcetonurie).

B. Malabsorbtie de vitamină B12:

C. Defecte in tranportul şi metabolismul intracelular al vitaminei B12:

II. Deficitul de folati

A. Dieta deficitară (prematuri, dieta exclusiv lactată la sugari fără suplimentare cu folati, dieta restrictivă din fenilcetonurie, abuzul de alcool)

B. Nevoi crescute: sarcină, alăptare, copii in perioada de crestere, anemia hemolitica cronică, boli neoplazice, hipertiroidism

C. Pierderi crescute: dializă cronică

D. Malabsorbtie de folati:

E. Deficit de folati indus toxic/medicamentos: abuzul de alcool, sulfasalazina, anticonvulsivante (in special hidantoinele; acidul valproic), antifolati (metotrexat, trimetoprim-sulfametoxazol, pirimetamina), contraceptivele orale.

F. Defecte mostenite ale transportului şi metabolismului:

IV. Defecte ale sintezei ADN induse toxic/medicamentos:

V. Cauze diverse: eritroleucemie, leucemie acută mieloida, sindrom mielodisplazic^3;7

Anemiile macrocitare non-megaloblastice⁷ nu au un mecanism patogenic comun; ele reprezintă anemiile macrocitare in care precursorii eritroizi medulari sunt normali; sinteza ADN nu este afectată; VEM este de obicei, uşor crescut (100 – 110 fL).

Clasificarea anemiilor macrocitare non-megaloblastice⁷

I.  Asociate cu eritropoieza accelerată: anemia hemolitică şi posthemoragică

II. Alcoolism (creşterea medie este ~5 fL, adică 5-10% peste valoarea medie a subiectilor de control; normalizarea VEM se produce dupa 3-4 săptămani de abstinentă); VEM reprezintă un test screening util pentru depistarea alcoolismului ocult.

III. Boli hepatice

IV. Sindroame mielodisplazice

V. Anemia mieloftizică

VI. Anemia aplastică

VII. Anemia sideroblastică dobandită

VIII. Anemia diseritropoietică ereditară (tipurile I şi III)

IX. Anemia Diamond-Blackfan

X. Hipotiroidism

Interferente

1. Prezenta de dublă populatie eritrocitară (micro- şi macrocitară, cand se asociază anemia feriprivă cu anemia megaloblastică) poate determina un VEM normal. In această situatie RDW este >15, pe histograma efectuată de analizorul automat se observă aspectul caracteristic de “curbă cu două cocoaşe”, iar confirmarea prezentei dublei populatii eritrocitare se face prin examinarea frotiului de sange. Dubla populatie este caracteristică pentru anemiile sideroblastice (o populatie microcitară hipocromă şi una relativ normocitară) şi anemiei feriprive după inceperea terapiei de substitutie cu fier.

2. VEM fals crescut: reticulocitoza marcată (>50%), leucocitoza marcată (>50000/µL) hiperglicemie marcată (>600 mg/dl), prezenta de aglutinine la rece, intoxicatia cu metanol (şi, in consecintă creşte Hct, iar CHEM scade).

3. VEM fals scăzut: hemoliza in vitro, prezenta de eritrocite fragmentate, excesul de EDTA.

4. Dacă pragul inferior al analizorului este fixat prea sus, este calculat un VEM mai mare deoarece eritrocitele mai mici nu sunt măsurate, iar dacă pragul superior este prea mare sunt măsurate şi leucocitele, iar VEM este crescut^4;6;8;15;18.

Hemoglobina eritrocitară medie (HEM) – este o măsura a continutului mediu de hemoglobină pe eritrocit

Metoda de determinare – HEM este calculat de analizorul automat conform formulei:

                   Hb(g/dL) x 10

HEM =    ——————–

                 Nr.Er.(x10⁶/μL)

Valori de referintă – HEM se exprimă in picograme (pg/10^-12g). Valorile normale la adult sunt 26–34 pg sau 0.4-0.53 fmol (valori mai mari la nou-născut; vezi anexa 7.1.1).

Semnificatie clinică – in majoritatea anemiilor HEM se corelează cu VEM, astfel anemiile microcitare sunt de obicei hipocrome (uneori hipocromia poate preceda microcitoza), cele normocitare sunt de obicei normocrome, iar conditiile care cresc HEM determină in general, dacă nu intotdeauna, VEM crescut, deoarece continutul eritrocitar normal de Hb este ~95% din concentratia de Hb maxim posibilă (anemiile macrocitare, anemia regenerativa observată de exemplu in timpul substitutiei cu fier a anemiei feriprive, la nou-născut)

Interferente

1. Hiperlipidemia, leucocitoza >50000/μL determină HEM fals crescut (Hb fals crescută)

2. Concentratie crescută de heparină determină HEM fals crescut

3. Prezenta aglutininelor la rece determină HEM fals crescut^4;6;8;15;18

Concentratia eritrocitară medie de hemoglobină (CHEM) – măsoară concentratia medie de Hb dintr-un volum dat de eritrocite (sau raportul dintre masă de Hb şi volumul de eritrocite)

Metoda de determinare – CHEM este calculat de analizorul automat conform formulei⁹:

                  Hb (g/dL) x 100

CHEM =    ——————–

                       Hct (%)

Valori de referintă – CHEM se exprimă in g/dL. Valorile normale la adult sunt 32-36 g/dL (320-360 g/L) (vezi anexa 7.1.1)⁹.

Semnificatie clinică – VEM este un indice extrem de valoros in clasificarea anemiilor, dar HEM şi CHEM, de obicei, nu aduc in plus informatii relevante clinic. Totuşi, au un rol important in controlul de calitate al laboratorului, deoarece aceşti indici variază foarte putin de la o zi la alta pentru un specimen dat, dacă pacientul nu este transfuzat.

Datorită comportamentului similar al volumului eritrocitar şi continutului in Hb al fiecărui eritrocit in parte, CHEM rămane constant in multe afectiuni hematopoietice^4;6;8;16;19.

1. CHEM scăzut (<30g/dL): apare in anemiile hipocrome (anemia feriprivă, unele talasemii)

2. CHEM crescut: cu exceptia sferocitozei ereditare şi a unor cazuri homozigote de siclemie şi hemoglobina C, CHEM nu depaşeste valoarea de 37 g/dL; această valoare este aproape de nivelul de solubilitate a Hb şi creşterea in continuare a concentratiei de Hb poate duce la cristalizarea ei. Acuratetea determinării CHEM depinde de factorii care afectează măsurarea fie a Hct, fie a Hb.

Interferente

1. CHEM poate fi fals crescut in hiperlipemie, prezenta de aglutinine la rece in titru mare, prezenta de rulouri

2. In hiperglicemia marcată (>600 mg/dL) CHEM poate fi fals scăzut (VEM si Hct fals crescute) ^4;6;8;16;19

Lărgimea distributiei eritrocitare (RDW) – este un indice eritrocitar care cuantifică heterogenitatea volumului celular (gradului de anizocitoză)

Metoda de determinare – RDW este calculat de analizorul automat in functie de prezenta de anomalii ale frecventei relative la anumite niveluri de discriminare, existenta a două sau a mai multor “peak”-uri şi lărgime de distributie anormală. Distributia VEM intr-o proba este prezentată sub forma unui grafic in care pe abscisa se proiectează volumul eritrocitar, iar pe ordonată frecventa relativă⁹.

                               Deviatia standard a mărimii eritrocitelor x 100

RDW (CV%) =   ————————————————————-

                                                                  VEM

Valori de referintă – 11.6-14.8 coeficient de variatie (CV) a volumului eritrocitar⁹

Semnificatie clinică

RDW este util in caracterizarea initială a anemiilor, in particular a anemiei microcitare, deşi alte teste sunt de obicei necesare pentru confirmarea diagnosticului. Astfel RDW este util in diferentierea beta-talasemiei minore necomplicate, in care VEM este scăzut, iar RDW normal de anemia feriprivă, in care VEM este scăzut, iar RDW crescut (creşterea RDW este un semn precoce in deficitul de fier)⁷. RDW este usor crescut in beta-talasemia minoră cu anemie uşoară⁴ . Unele studii au arătat că RDW nu diferentiază beta-talasemia minoră de anemia feriprivă decat dacă este utilizat un cut-off mai mare (17%)⁴. De asemenea permite diferentierea intre anemia din bolile cronice (VEM normal/scăzut, RDW normal) şi anemia feriprivă incipientă (VEM normal/scăzut, RDW crescut)^7;16.

RDW crescut: anemia feriprivă, anemia megaloblastică, diferite hemoglobinopatii (S, S-C, S-β-talasemia), anemia hemolitică imună, reticulocitoza marcată, prezenta de fragmente eritrocitare, aglutinare, dimorfism eritrocitar (inclusiv pacientii transfuzati sau cei tratati recent pentru deficiente nutritionale)

RDW normal: anemia din bolile cronice, beta-talasemia heterozigota, anemia hemoragică acută, anemia aplastică, sferocitoza ereditară, boala cu Hb E, siclemia

Nu există o cauză cunoscută pentru RDW scăzut^4;6;8;16;19.

Interferente:

1. Alcoolismul creşte RDW

2. Prezenta aglutininelor la rece^4;6;8;16

 Reticulocitele

Reticulocitele sunt eritrocite anucleate tinere, imature, care contin acizi nucleici reziduali (ARN). După expulzarea nucleului eritrocitele răman in măduvă pană la 4 zile, timp in care are loc o scădere continuă a numărului de poliribozomi (care contin ARN) şi a sintezei de hemoglobină. Aceste eritrocite tinere se maturizează complet in circulatia periferică in circa 1-2 zile după ce părăsesc măduva osoasă, timp in care pierd complet capacitatea de sinteză proteică (respectiv poliribozomii care contin ARN), iar sinteza de Hb incetează. Reticulocitele apar pe frotiul colorat Wright-Giemsa ca celule policromatofile (materialul nucleic reticular se colorează in albastru-gri) de volum mai mare decat cel al eritrocitelor mature. Materialul reticular se colorează cu coloranti supravitali ca albastru cresil briliant/albastru de metilen. In mod normal, in absenta anemiei, un număr mic de reticulocite este prezent in circulatie (in fiecare zi ~1% din eritrocite sunt inlocuite cu eritrocite tinere eliberate din măduvă). Determinarea numărului de reticulocite oferă informatii despre capacitatea medulară de a sintetiza celule rosii ca răspuns la o suprasolicitare fiziologică, cum este anemia^4;6-8;16;19.

Indicatii:

1. Diferentierea tipurilor de anemii in: neregenerative şi regenerative/hiper-regenerative

2. Monitorizarea răspunsului la tratamentul de sustitutie cu fier, acid folic/vitamina B12

3. Evaluarea eritropoiezei după transplant medular, in anemia aplastică indusă de medicamente citotoxice/sau in tratamentul cu eritropoietină

Metoda de determinare

1. Metoda manuală – numărare microscopică

2. Numărarea automată – analizor automat pe principiul citometriei in flux cu fluorescentă şi LASER semiconductor

Valori de referintă

Adult: 0.5-2% din nr. total de Er.

Nou-născut: 2.5-6.5% din nr. total de Er (scade la nivelul de la adult din a doua săptămană de viată)

Nr. absolut = 30-120 x 10³/μL sau x 10⁹/L.

In prezenta anemiei nr. de Rt trebuie corectat deoarece este fals crescut cand se raportează la nr. scăzut de Er al pacientului anemic^5;7:

`                                  %Rt x Hct pacientului

% Rt corectat = —————————————-

                                                         45

In continuare trebuie făcută o corectie suplimentară deoarece Rt eliberate sub stimularea intensă a eritropoietinei răman in circulatie un timp aproximativ dublu fată de timpul de supravietuire al Rt normale (aproximativ o zi). Se calculează astfel indicele de productie reticulocitară (IPR)⁵ din %Rt corectat şi un factor de corectie care depinde de Hct pacientului:

Hct (%)                               Factor de corectie

40-45                                               1.0

35-39                                               1.5

25-34                                               2.0

15-24                                               2.5

<15                                                3.0

IPR = % Rt corectat/factorul de corectie

Un IPR <2 indică un răspuns medular inadecvat, in timp ce un IPR >2 sugerează că măduva osoasă răspunde adecvat gradului de anemie⁵.

Semnificatie clinică – determinarea nr. relativ sau absolut de Rt reprezintă un indicator important al activitătii eritropoietice medulare, furnizand o apreciere initială dacă anemia se datorează alterării productiei eritrocitare sau pierderii de eritrocite in circulatie (prin sangerare sau hemoliză) ^1;4;5.

1. Număr crescut de reticulocite (reticulocitoza): este indicator de eritropoieză regenerativă (cresterea productiei eritrocitare medulare sub actiunea eritropoietinei; sub stimulare maximă măduva poate produce eritrocite de 6-8 ori mai mult fată de rata normală).

Sindroamele hemolitice usoare se pot asocia cu concentratii normale de Hb şi reticulocitoză de 2-5%.

Anemiile hemolitice acute se pot asocia cu reticulocitoză de >50%.

In hipersplenism este prezentă o anemie hemolitică uşoară cu număr de Rt uşor crescut.

2. Număr scăzut de reticulocite (reticulocitopenia): apare in anemii non-regenerative, cum ar fi deficitul de fier/folat/vitamina B12, aplazia medulară (deficitul persistent de Rt sugerează un prognostic prost), anemia din bolile cronice, insuficienta medulară (anemia mieloftizica).

Determinarea numărului de Rt are importantă in special in anemia normocitară. Anemia microcitară cu feritină şi saturatie a transferinei normale şi nr. de Rt crescut sugerează o hemoglobinopatie. Reticulocitoza in combinatie cu anemia macrocitară sugerează deficit de folat/vitamina B12 partial tratat, iar anemia hemolitică poate fi uşor macrocitară^4;5.

Unele analizoare furnizează un parametru suplimentar: fractia reticulocitelor imature (IRF). Stabilirea indexului de maturitate a reticulocitelor furnizează informatii complementare numărului de reticulocite in evaluarea activitătii eritropoietice.

IFR reprezintă procentul de reticulocite care au un continut crescut sau intermediar de ARN.

Valorile de referintă specifice metodei de lucru a laboratorului nostru sunt diferite in functie de sex:

bărbati: 2.3-13.4%

femei: 3.0-15.9%.

Studiile efectuate au arătat faptul că IRF constituie un indicator mai sensibil şi mai specific decat numărul de reticulocite determinat izolat, in următoarele situatii clinice:

Referitor la clasificarea anemiilor, in tabelul de mai jos sunt prezentate modificările numărului absolut de reticulocite şi al FRI in diverse tipuri de anemie:

In concluzie, IRF corelat cu numărul de reticulocite constituie un indicator util al activitătii eritropoietice, furnizand informatii similare cu indicele productiei reticulocitare (IPR), care fiind insă un  parametru calculat şi nu un rezultat al măsurării directe poate fi inlocuit de acestea⁹.

Numarul de trombocite (numarul de plachete)  

Trombocitele sunt fragmente citoplasmatice anucleate bogate in granule, rotund-ovalare, plate, in formă de disc, cu diametrul de 2-4μ. Trombopoieza are loc in măduva osoasă incepand cu celula progenitoare multipotentă, continuă cu megakariocitopoieza care include proliferarea megakariocitară şimaturarea megakariocitelor cu formarea de trombocite. In mod normal, două treimi din trombocite se găsesc in circulatie, iar o treime sunt stocate in splină. Trombocitele sunt implicate in hemostază şi in initierea proceselor de reparare tisulară şi vasoconstrictie după injuria vasculară şi in timpul proceselor inflamatorii, aderarea şi agregarea plachetară avand ca rezultat formarea trombusului plachetar care astupă rupturile din peretii vaselor mici.

Indicatii

Metoda de determinare – trombocitele sunt numărate de analizorul automat prin aceeaşi metodă ca eritrocitele, in timpul directionării lor intr-un singur rand printr-un orificiu, prin metoda de focusare hidrodinamică⁹.

O estimare a numărului de trombocite pe un frotiu de sange bine efectuat constituie un control valoros al numărului de trombocite determinat prin metoda automată. In general, cand frotiul este examinat cu obiectivul de 100x fiecare trombocit observat/camp reprezintă ~10000 Tr x10⁶/L. In consecintă, un frotiu normal trebuie să prezinte in medie cel putin 14 Tr/camp¹⁵.

Valori de referintă⁹ – 150-450 x 10³/μL.

Semnificatie clinică

1. Creşterea numărului de trombocite (trombocitoza/trombocitemie)

A. Trombocitoza tranzitorie – se datorează mobilizării trombocitelor din pool-ul extravascular: efort fizic, naştere, administrare de epinefrina

B. Trombocitoza primară:

C. Trombocitoza secundară/reactivă (productia persistentă a unuia sau mai multor factori trombopoietici, in special interleukina 6, care actionează asupra megakariocitelor):

In sindroamele mieloproliferative cronice trombocitoza este frecventă şi poate constitui un mecanism fiziopatologic important in producerea hemoragiei şi trombozei. Trombocitele circulante sunt mari, dismorfice şi anormale functional. Pacientii cu trombocitoza reactivă pot avea valori ale trombocitelor la fel de mari ca in bolile mieloproliferative (de ordinul milioanelor), dar hemoragia şi tromboza sunt neobisnuite. Trombocitele circulante sunt mari, rotunde, normale functional^4;13.

2. Scăderea numărului de trombocite (trombocitopenia): este cea mai frecventă cauză de sangerare. Trombocitopenia poate apărea prin mecanisme diferite:

A. Distructie accelerată a trombocitelor: este cea mai frecventă cauză de trombocitopenie; aceasta determină stimularea trombopoiezei ducand la cresterea numărului, mărimii şi maturatiei megakariocitelor medulare

B. Productie scăzută de trombocite:

C. Distributie anormală a trombocitelor:

Numeroase medicamente au fost asociate cu trombocitopenia imună. Cele mai comune medicamente incriminate sunt: heparina (1% din pacienti), quinidina, quinina, rifampicina, trimetoprim-sulfametoxazol, danazol, metildopa, acetaminofen, digoxin, interferon-alfa etc.

Trombocitopenia se asociază clinic cu sangerari cutaneo-mucoase: petesii, purpura, gingivoragii, epistaxis, pană la sangerari gastrointestinale, pulmonare şi genitourinare. Sangerările spontane sunt rare la >60×10³Tr/μL (pot apărea sangerări posttraumatice, postoperatorii) ^12;17.

Valori critice

1. Trombocitoza >1.5×10⁹/μL, precum şi trombocitoza la pacienti varstnici şi/sau cu boli cardiovasculare prezintă risc de tromboză, mai rar de hemoragie⁶

2.  Trombocitopenia <20×10³/μL se asociază cu risc de sangerări spontane interne/externe (risc 1% de hemoragii intracraniene)⁶

Interferente

1. Trombocitele cresc la altitudine, in timpul iernii, după efort fizic intens, traume

2. Trombocitele scad inaintea menstruatiei şi in sarcină

3. O falsă trombocitopenie poate fi indicată de analizorul automat şi se datorează unei erori de numărare:

4. Prezenta de fragmente eritrocitare, microsferocite, fragmente leucocitare (fragmente nucleare şi citoplasmatice limfocitare in leucemia limfoida cronica) poate determina niveluri fals crescute ale trombocitelor^{4;6;8;16;17;19}.

5. Interferente medicamentoase:

Volumul trombocitar mediu (VTM)^4;6;16;17 – indică uniformitatea de mărime a populatiei trombocitare. Este util in diagnosticul diferential al trombocitopeniei^4;6;16;17

Metoda de determinare: este calculat de analizorul automat după următoarea formulă:

                            PCT (Plachetocrit) (%)

VTM (fL) = ————————————- x1000

                              Nr. trombocite (x10³/μL)

De asemenea, analizorul automat calculează lărgimea distributiei trombocitare (PDW) asemănător cu calcularea lărgimii distributiei eritrocitare⁹

Valori de referintă –  VTM = 7.4-13 fL sau μm³

PDW = 8-16.5 coeficient de variatie (CV) a volumului trombocitar⁹

Semnificatie clinică – VTM poate fi utilizat impreună cu PDW pentru distingerea conditiilor asociate cu productie scazută de trombocite de cele asociate cu distructie plachetară crescută.

1. VTM crescut:

In general VTM variază invers proportional cu numărul de trombocite, cu volume plachetare mai mari observate la pacientii trombocitopenici la care trombocitele sunt scăzute datorită distructiei periferice si unui turn-over plachetar crescut (ca in purpura trombocitopenică idiopatică)¹⁶.

VTM este caracteristic crescut in hipertiroidism şi in bolile mieloproliferative ^4;16.

In trombocitopoieza ineficientă asociată cu hematopoieza megaloblastică din deficitul de vitamina B12 şi/sau acid folic trombocitele circulante sunt anormal de mari.

VTM poate fi crescut după splenectomie; este crescut in pre-eclampsie, la fumătorii aterosclerotici (cresterea VTM la fumători a fost propusă ca factor de risc pentru ateroscleroză)⁴.

Plachete mari sunt prezente in faza de recuperare după trombocitopenia indusă de alcool⁴. Există cateva forme de trombocitopenie ereditară caracterizate prin prezenta de trombocite gigante (VTM = 16-30 fL): sindromul Bernard-Soulier şi macrotrombocitopeniile ereditare cu transmitere autosomal dominantă (sindroamele Fechtner, Sebastian, May-Hegglin si Epstein)^16;19.

In trombocitoză, VTM este de obicei crescut in bolile mieloproliferative (asociat cu morfologie anormală) şi normal in trombocitozele reactive (infectii, tumori, boli inflamatorii etc.)¹³.

2. VTM scăzut:

Numărul de trombocite şi VTM sunt de obicei scăzute in conditiile asociate cu alterarea productiei de trombocite: hipoplazia megakariocitara, anemia aplastică, chimioterapie, de asemenea in trombocitopenia septică^4;16;17. Odată cu ameliorarea tabloului clinic şi refacerea după chimioterapie, VTM creste inaintea cresterii numărului de trombocite.

Pacientii cu hipersplenism au trombocite mai mici decat cei cu PTI, astfel mărimea trombocitelor poate servi ca mijloc pentru diferentierea intre trombocitopenia cauzată de distructia imunologică a plachetelor fată de sindroamele cu splenomegalie^4;16.

Prezenta de fragmente trombocitare (de ex. in leucemie) se poate asocia cu VTM scăzut⁴.

Dintre trombocitopeniile ereditare sindromul Wiskott-Aldrich şi trombocitopenia X-linkată se asociază cu microcitoza trombocitară (VTM ~jumătate fată de valorile normale)^10;19.

Există dovezi că VTM se corelează cu tendinta de sangerare la pacientii trombocitopenici: la VTM >6.4 fL scade semnificativ frecventa sangerarilor; astfel VTM ar putea fi util in aprecierea oportunitătii administrării de transfuzii de trombocite⁴.

Interferente

Plachetele tind să se măreasca in primele două ore in EDTA, micsorandu-se din nou o dată cu prelungirea stocării probei, făcand dificilă standardizarea măsurătorilor. De aceea interpretarea VTM şi PDW trebuie facută cu precautie¹⁶. VTM şi PDW pot avea valori false dacă numărul de Tr este <10000/µL⁴.

Numărul de leucocite (numărul de celule albe) şi formula leucocitară

Leucocitele se impart in două grupe principale: granulocite şi a-/non-granulocite. Granulocitele sunt denumite astfel datorită prezentei in citoplasmă de granulatii distincte şi se identifică trei tipuri de granulocite in functie de afinitătile de colorare pe frotiul de sange colorat Wright: neutrofile, eozinofile şi bazofile. De asemenea, aceste celule sunt denumite şi leucocite polimorfonucleare datorită nucleului multilobulat. Nongranulocitele care constau din limfocite şi monocite nu contin in general granulatii citoplasmatice distincte şi au nucleul nonlobulat, fiind denumite şi leucocite mononucleare^{2;4;6;8;12;16;18-20}.

Indicatii – evaluarea infectiilor, inflamatiilor, necrozelor tisulare, intoxicatiilor, alergiilor, bolilor mieloproliferative şi limfoproliferative acute şi cronice, tumorilor maligne, depresiei medulare (iradiere, medicamente citotoxice, imunosupresoare, antitiroidiene etc.)^6;8;12.

Metoda de determinare – leucocitele sunt determinate de analizorul automat (după ce hematiile sunt lizate, iar leucocitele sunt colorate cu o substantă fluorescentă cu afinitate pentru acizii nucleici) prin metoda de citometrie in flux cu fluorescenta utilizand LASER semiconductor. De asemenea, sunt efectuate două scatergrame bidimensionale. In scatergrama 4 DIFF axa x reprezintă intensitatea luminii dispersate lateral (respectiv complexitatea internă a celulelor), iar axa y intensitatea fluorescentei laterale (respectiv continutul de acizi nucleici), sunt proiectate cele cinci clase leucocitare şi grupul de umbre eritrocitare, precum şi anumite semnale de avertizare. In scatergrama WBC/BASO axa x reprezintă intensitatea luminii dispersate lateral, iar axa y intensitatea luminii dispersate frontal (respectiv mărimea celulelor) şi sunt proiectate trei grupuri, respectiv grupul de umbre eritrocitare, grupul de  bazofile şi grupul de alte leucocite⁹.

Valori de referintă – la adult = 4000-10000/µL sau 4-10×10⁹/L

                                        – la copii valori mai mari, diferite in functie de varstă (vezi anexa7.1.1).

Semnificatie clinică

1. Variatii fiziologice ale leucocitelor

Majoritatea variatiilor fiziologice se explică prin stimularea cortexului adrenal. Administrarea de cortizon si hidrocortizon se asociază cu neutrofilie (datorată probabil scăderii refluxului din sange şi creşterii eliberării medulare), urmată de eozinopenie şi limfopenie¹⁸.

2. Leucocitoza: L >10000/µL sau >10×10⁹/L – se datorează de obicei unei creşteri a numărului de neutrofile sau limfocite; mai rar celelalte clase de leucocite determină creşterea numărului absolut de leucocite. O creştere proportională a tuturor tipurilor de leucocite se datorează hemoconcentratiei.

3. Leucopenie: <4000/µL sau <4×10⁹/L (valorile cuprinse intre 2500-4000/µL sunt considerate borderline, in timp ce valorile <2500/µL sunt cert anormale)  se poate datora următoarelor cauze:

Interferente

1. Număr fals crescut de leucocite: prezenta de eritrocite rezistente la liza (la nou-născuti, reticulocitoza), prezenta de eritroblasti circulanti in număr mare, trombocitele gigante (pot fi numărate ca leucocite), prezenta de crioglobuline (la temperatura camerei se formează cristale proteice care sunt numărate ca leucocite; dispar după incălzirea probei la 37°C), paraproteinemia, prezenta de aglutinine la rece.

2. Număr fals scăzut de leucocite: prezenta de leucocite alterate (chimioterapie, sepsis) – nu sunt incluse in numărătoare^4;6;8;19.

Valori critice – număr de leucocite <500/µL, respectiv >30000/µL⁶.

Formula leucocitară constă in diferentierea numărului total de leucocite circulante in cele cinci tipuri de leucocite, exprimate procentual şi respectiv in număr absolut, fiecare dintre acestea indeplinind o functie specifică. Actualmente este de preferat raportarea fiecărui tip de leucocite in valori absolute. Formula leucocitară este efectuată automat de către analizor. Există anumite situatii insă in care este necesară efectuarea manuală a formulei leucocitare: număr de leucocite prea mic/prea mare, prezenta de celule anormale semnalizată de analizor prin anumite mesaje de avertizare/chiar esecul analizorului de a indica formula leucocitară. In aceste cazuri se efectuează numărătoarea microscopică: frotiu de sange venos (recoltat pe EDTA; heparina poate produce deformări ale leucocitelor) sau frotiu de sange capilar⁹.

Neutrofilele (granulocitele polimorfonucleare neutrofile) – cel mai numeros tip de leucocite, joacă un rol major in apărarea antiinfectioasă primară a organismului prin fagocitarea şi digestia microorganismelor, iar activarea lor necorespunzatoare poate duce la lezarea tesuturilor normale ale organismului prin eliberarea de enzime şi agenti piogeni. In momentul aparitiei infectiei sunt produsi agenti chemotactici care determină migrarea neutrofilelor la locul infectiei şi activarea functiilor defensive ale acestora, cu fagocitarea agentului respectiv, urmată de eliberarea granulelor in vezicula de fagocitoză şi distrugerea agentului infectios. Acest efect este adesea asociat cu cresterea productiei şi eliberarii neutrofilelor din măduva osoasă.

Granulopoieza are loc la nivelul măduvei osoase, considerandu-se ca granulocitele neutrofile, eozinofile si bazofile urmează acelasi model de proliferare, diferentiere, maturare si eliberare in sange. Mieloblastii, promielocitele si mielocitele reprezintă compartimentul mitotic, celulele fiind capabile de replicare, iar metamielocitele, neutrofilele nesegmentate si neutrofilele segmentate reprezintă compartimentul postmitotic/de diferentiere. In afara măduvei osoase, granulocitele neutrofile se găsesc in tesuturi, circulante la nivelul vaselor de sange si marginate care aderă la endoteliul vascular. Cresterea neutrofilelor circulante se datorează fie eliberării din măduva osoasă, fie mobilizării neutrofilelor marginate. In cazul unei stimulări puternice metamielocitele si mielocitele pot ajunge in sangele periferic¹⁸.

Valori de referintă: –  la adult = 2000-8000/µL sau 2-8×10⁹/L; 45-80% din leucocite

                                         –  la copii valori mai mici in functie de varstă⁹ (vezi anexa 7.1.1)

Semnificatie clinică

1. Neutrofilia: >8000/µL sau 8×10⁹/L:

2. Neutropenia: se clasifica in uşoara (1000-1500/µL), moderata (500-1000/µL) şi severa (<500/µL); agranulocitoza reprezinta o forma severa de neutropenie cu absenta totala a neutrofilelor circulante. Neutropenia severa se asociaza cu risc crescut de infectii cu localizare orala (ulcere, periodontita), cutaneo-mucoasa (piele, perirectal, genital), iar in neutropenia prelungita infectii sistemice (pulmonare, gastrointestinale, hematogene). Cauze de neutropenie:

 A. Pseudoneutropenia: efectuarea hemogramei dupa un timp indelungat de la recoltare, prezenta paraproteinemiei care produce aglutinarea neutrofilelor, marginarea neutrofilelor.

 B. Neutropenia dobandita:

C. Neutropenia congenitala şi cronica:

Interferente – vezi variatii fiziologice ale leucocitelor, pseudoneutrofilia şi pseudoneutropenia.

Valori critice – numar de neutrofile <200/µL sau agranulocitoza – risc de infectii sistemice fatale.

Limfocitele – reprezinta o populatie celulara heterogena care difera in functie de origine, durata de viata, localizare la nivelul organelor limfoide şi functie. Deşi unele caracteristici morfologice ca: marimea, granularitatea, raportul nucleo-citoplasmatic diferentiaza populatiile limfocitare una de cealalta, ele nu ofera indicii privind tipul şi functia lor. Majoritatea limfocitelor din sange sunt mici, deşi sunt comune şi forme mai mari, cum ar fi limfocitele mari granulare care contin granulatii azurofile in citoplasma.

65-80% din limfocite sunt celule T, 8-15% sunt celule B, iar ~10% sunt celule natural killer (NK) (celulele NK sunt morfologic distincte, unele dintre acestea fiind identice cu limfocitele mari granulare). Numai 2% din limfocite sunt prezente in sange. Limfopoieza are loc la nivelul organelor limfoide. Organele limfoide primare sunt maduva osoasa şi timusul, unde are loc diferentierea antigen-independenta a limfocitelor din precursorii imaturi (limfocitele B se matureaza in maduva, iar limfocitele T in timus unde migreaza de la nivel medular). Dupa acest stadiu precoce de diferentiere, limfocitele imunocompetente sunt eliberate şi se localizeaza in arii specifice din organele limfoide secundare: splina, ganglionii limfatici, placile Peyer de la nivelul intestinului şi inelul Waldeyer, unde are loc stadiul final, antigen-dependent al diferentierii limfocitare şi distribuirea de celule efectoare complet diferentiate a produşilor acestora spre alte zone ale organismului.

Plasmocitele reprezinta celule B complet diferentiate, cu citoplasma abundenta, intens bazofila, uneori granulara şi nucleu excentric, rotund-ovalar, cu cromatina densa cu aspect de “spite de roata”. Plasmocitele nu sunt prezente in mod normal in sange. Frecvent sunt intalnite celule intermediare (limfoplasmocite), ca in infectiile virale, inclusiv mononucleoza infectioasa sau in bolile imunologice cu hipergamaglobulinemie.

Celulele B controleaza raspunsul imun umoral mediat de anticorpi specifici antigenului ofensator. Celulele B cu memorie au durata lunga de viata şi nu produc anticorpi pana in momentul restimularii antigenice, cand raspund la doze mult mai mici de antigen, prolifereaza clonal şi produc o cantitate de anticorpi de 7-10 ori mai mare decat celule B neexperimentate antigenic.

Celulele T sunt implicate in raspunsul imun mediat celular şi includ celulele T helper CD4⁺, celulele T supresor CD8⁺ şi celulele T citotoxice^6;15;19.

Valori de referinta – adult: 1000-4000/µL sau 1-4×10⁹/L; 20-55% din leucocite;

                                        – la copii valori mai mari in functie de varsta⁹ (vezi anexa7.1.1).

Semnificatie clinica

1. Limfocitoza: >4000/µL:

 A. Cauze benigne:

B. Cauze maligne:

2. Limfopenie: <1000/µL:

3. Plasmocitele: nu sunt prezente in mod normal in sange; sunt crescute in:

Interferente – vezi variatii fiziologice ale leucocitelor; efortul fizic, stresul, menstruatia pot produce limfocitoza.

Interferente medicamentoase⁶:

Valori critice – numar de limfocite <500/µL creşte riscul de infectii, in special virale⁶

Numar de celule CD4⁺ sever scazut este cel mai bun indicator unic de infectii oportuniste¹⁸

Monocitele – sunt cele mai mari celule din sange; fac parte din sistemul fagocitic mononuclear/reticuloendotelial compus din monocite, macrofage şi precursorii lor medulari. Monocitele sunt eliberate in sange şi, dupa un scurt timp in circulatie, migreaza in diferite tesuturi, intamplator sau specific, ca raspuns la diferiti factori chemotactici. In tesuturi, ca raspuns la diferiti stimuli solubili, ele se diferentiaza in macrofage tisulare, cu calitati morfologice si functionale caracteristice, proces care a fost denumit activare şi care este reversibil (“dezactivare”). Celulele sistemului fagocitic mononuclear sunt foarte primitive filogenetic, nici un animal neputand trai fara ele. Indeplinesc o varietate larga de functii importante in organism, incluzand indepartarea particulelor straine şi celulelor senescente, moarte sau alterate, reglarea functiilor altor celule, procesarea şi prezentarea de antigene in reactiile imune, participarea in diferite reactii inflamatorii, distrugerea bacteriilor şi celulelor tumorale. Monocitele şi macrofagele produc numerosi factori bioactivi: enzime, factori ai complementului, factori de coagulare, specii reactive de oxigen şi azot, factori angiogenetici, proteine de legare (transferina, transcobalamina II, fibronectina, apolipoproteina E), lipide bioactive (derivati ai acidului arahidonic), factori chemotactici, citokine şi factori de creştere (IFN α şi γ, IL 1,3,6,8,10,12, FGF, PDGF, TNF, M-CSF) ^1;6;16.

Valori de referinta – 0-1000/µL sau 0-1×10⁹/L; 0-15% din leucocite⁹.

Semnificatie clinica

1. Monocitoza: >1000/µL:

2. Monocitopenie: <100/µL (conditie extrem de rara):

Interferente – vezi variatii fiziologice ale leucocitelor.

Interferente medicamentoase:

Cresc monocitele: alprazolam, ampicilina, carbenicilina, clorpromazina, griseofulvin, haloperidol, lomefloxacin, metsuximid, penicilamina, piperacilina, prednison, propiltiouracil, quazepam.

Scad monocitele: alprazolam, triazolam⁶.

Eozinofilele (granulocitele eozinofile)^6;9;18– au fost initial descrise pentru granulatiile lor intracitoplasmatice caracteristice care manifesta afinitate crescuta pentru colorantii acizi, cum ar fi eozina, şi care apar colorate roşu-stralucitor in microscopia optica. Eozinofilele sunt celule mobile, cu originea in maduva osoasa, urmand acelaşi model de proliferare, diferentiere, maturare şi eliberare in sange ca şi granulocitele neutrofile; nucleul lor este de obicei bilobat, dar sunt adesea observati şi trei sau mai multi lobi.

La indivizii sanatosi se gasesc in numar mic in sange, dar devin predominante in sange şi tesuturi in asociere cu diferite boli alergice, parazitare sau boli maligne. Prezenta eozinofilelor in caile respiratorii şi mucoasa intestinala, numarul cat şi starea lor de activare, a fost asociata atat cu maifestarile IgE-dependente cat şi IgE-independente ale bolilor alergice. Totusi, rolul imunologic şi importanta eozinofilului in patogeneza astmului nu sunt pe deplin clarificate. Eozinofilele contin cel putin cinci tipuri diferite de granulatii intracitoplasmatice; granulatiile cristaloide contin cea mai mare parte a proteinelor cationice cu incarcatura mare, incluzand proteina bazica majora, peroxidaza, proteina cationica eozinofilica si neurotoxina derivata din eozinofil, implicate in alterarile tisulare observate in astm şi alte boli alergice. Eozinofilia indusa de alergeni sau paraziti este dependenta de celula T şi este mediata de citokine eliberate de limfocitele sensibilizate. Eozinofilul produce şi stocheaza pana la 29 de mediatori cunoscuti, citokine, chemokine şi factori de creştere, importante in reactiile inflamatorii in care este implicata aceasta celula (produşi ai acidului arahidonic, interleukine 1α-6, 8, 9-13, 16, IFNγ, TNF, TGFα, TGFβ1, NGF, PDGF-B,SCF, GM-CSF, eotaxina, MIP-1α, RANTES).

Valori de referinta: 0-700/µL sau 0-0.7×10⁹/L (0-7% din leucocite); valori mai mici la copiii pana la 1 an (vezi anexa 1).

Semnificatie clinica ^4;6;8;9;18

1. Eozinofilia >700/µL:

In plus, reactiile medicamentoase, sindromul hipereozinofilic şi infestatiile parazitare se pot asocia cu eozinofilie si infiltrate pulmonare

!Cele mai mari valori ale numarului de eozinofile (>1500/µL) apar in sindromul hipereozinofilic idiopatic, leucemia cu eozinofile, trichineloza si dermatita herpetiforma^6;18.

2. Eozinopenia se datoreaza in general unei productii crescute de steroizi, care acompaniaza majoritatea conditiilor de stres şi se asociaza cu:

Interferente ^4;6;8: vezi variatii fiziologice ale leucocitelor.

1. Ritmul circadian: numarul de eozinofile este minim dimineata şi creşte de la pranz pana dupa miezul noptii

2. Conditiile de stres scad numarul de eozinofile

3. Interferente medicamentoase:

Bazofilele (granulocitele bazofile) şi mastocitele – sunt doua populatii de leucocite bazofile care prezinta multe asemanari, dar şi unele diferente. Ambele tipuri de celule contin granulatii intracitoplasmatice care se coloreaza metacromatic cu coloranti bazici. De asemenea, ambele exprima pe suprafata lor o isoforma tetramerica (αβγ2) a receptorului cu afinitate mare pentru IgE. Cand acest receptor cu afinitate mare este legat de alergenul sensibilizant sau de anticorpii anti-IgE, atat bazofilele, cat şi mastocitele sunt activate, fiind indusa sinteza şi secretia de mediatori. Prin aceste mecanisme bazofilele şi mastocitele sunt factori importanti in inflamatiile alergice şi alte fenomene imune şi inflamatorii.

Bazofilele sunt celule avand kinetica şi istoria naturala a granulocitelor, care se matureaza in maduva, circula in sange şi retin anumite trasaturi ultrastructurale caracteristice dupa migrarea in tesuturi in timpul proceselor inflamatorii şi imunologice (hipersensibilitate cutanata bazofilica, astm). Nu exista evidente convingatoare ca bazofilele se metamorfozeaza in mastocite dupa migrarea in tesuturi.

Mastocitele se matureaza in mod obişnuit in afara maduvei osoase sau circulatiei – in general in tesutul conjunctiv şi cavitatile seroase. Exista anumite conditii in care numarul de progenitori mastocitari din circulatie poate fi crescut.

Bazofilele şi mastocitele difera semnificativ in ceea ce priveste fenotipul de suprafata, forma şi structura nucleului; bazofilele au in general mai putine granule şi o morfologie mai omogena decat mastocitele. Exista, de asemenea, diferente in ceea ce priveste mediatorii stocati şi cei nou sintetizati dupa activare. Ambele celule contin histamina, PAF şi metaboliti ai acidului arahidonic, considerate importante in patogeneza bolilor inflamatorii, cum ar fi astmul. O distinctie majora consta in proteinazele care sunt continute in cantitate abundenta in mastocite. Ambele celule produc citokine, spre exemplu bazofilele produc cantitati mari de IL-4 si IL-13, in timp ce repertoriul mastocitelor include un spectru larg de citokine, asociate cu fenotipurile Th1 si Th2 (cum ar fi TNF).

De asemenea, rolul bazofilelor şi mastocitelor in inflamatiile alergice difera in functie de stimulii care activeaza fiecare celula. Cateva populatii mastocitare raspund la unele neuropeptide, iar asocierea anatomica stransa dintre mastocite şi nervi constituie evidenta componentei neurogenice-dependente de mastocite a reactiilor alergice.

Degranularea anafilactica survine dupa stimularea receptorului pentru IgE sau prin alti stimuli cum ar fi componente ale complementului. Degranularea anafilactica poate fi extensiva implicand majoritatea granulelor. Dar in numeroase reactii inflamatorii in care apare infiltrare mastocitara şi bazofilica, cum ar fi hipersensibilitatea cutanata intarziata, poate aparea o degranulare şi secretie de mediatori mult mai putin exploziva (“piecemeal degranulation”). Dupa degranulare, celule sunt capabile sa se refaca şi sa functioneze din nou².

Valori de referinta – bazofile = 0-200/µL sau 0-0.2×10⁹/L (0-2% din leucocite)⁹.

Semnificatie clinica

1. Bazofilia: >200/µL:

2. Bazopenia: <20/µL:

3. Prezenta de precursori mastocitari in sange:

Interferente medicamentoase:

Bibliografie

1. B Weinberg. Monunuclear Phagocytes. In Wintrobe’s Clinical Hematology. Philadelphia ed. 2004, 349-377.

2. Befus D, Denburg J. Basophilic Leukocytes: Mast Cells and Basophils. In Wintrobe’s Clinical Hematology. Lippincott, Williams, and Wilkins, Philadelphia, 11 ed. ed. 2004, 336-345.

3. Carmel L. Megaloblastic Anemias: Disorders of Impaired DNA Synthesis. In Wintrobe’s Clinical Hematology. Lippincott, Williams, and Wilkins, Philadelphia, 11 ed. 2004, 1367-1413.

4. DeMott W, Tilzer L. Hematology. In Laboratory Test Handbook. Hudson (Cleveland) ed. 1994, 517-617.

5. Desai S. Complete Blood Count. In Clinicians’s Guide to Laboratory Medicine. Hudson (Cleveland) ed. 2004, 13-18.

6. Fischbach F. Blood Studies: Hematology and Coagulation; Appendix J: Effects of the Most Commonly Used Drugs on Frequently Ordered Laboratory Tests. In A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 8 ed. 2009, 67-110, 1227-1247.

7. Glader B. Anemia: General Considerations. In Wintrobe’s Clinical Hematology, Philadelphia. 2004, 948-975.

8. J Wallach. Hematologic Diseases. In Interpretation of Diagnostic Tests. Philadelphia ed. 1996, 293-316.

9. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog

10. Lacy P, Becker A, Moqbel R. The Human Eosinophil. In Wintrobe’s Clinical Hematology. Philadelphia, ed. 2004, 311-329.

11. Levine S. Miscellaneous Causes of Thrombocytopenia. In Wintrobe’s Clinical Hematology, Philadelphia. Philadelphia ed. 2004, 1565-1570.

12. Levine S. Thrombocytopenia: Pathophysiology and Classification. In Wintrobe’s Clinical Hematology. Philadelphia ed. 2004, 1529-1531.

13. Levine S. Thrombocytosis. In Wintrobe’s Clinical Hematology. Philadelphia ed. 2004, 1591-1597.

14. Means R. Erythrocytosis. In Wintrobe’s Clinical Hematology. Philadelphia ed. 2004, 1495-1505.

15. Paraskevas F. Lymphocytes and Lymphatic Organs. In Wintrobe’s Clinical Hematology. Philadelphia, ed. 2004, 409-433.

16. Perkins S. Examination of the Blood and Bone Marrow. In Wintrobe’s Clinical Hematology. Philadelphia, ed. 2004, 3-21.

17. Rodgers G. Diagnostic Approach of the Bleeding Disorders. In Wintrobe’s Clinical Hematology. Philadelphia ed. 2004, 1511-1526.

18. Skubitz K. Neutrofilic Leukocytes. In Wintrobe’s Clinical Hematology. Philadelphia ed. 2004, 268-303.

19. Thomas L, Bartl R. Hematology. In Clinical Laboratory Diagnostics. 1998, 463-547.

20. Watts R. Neutropenia. In Wintrobe’s Clinical Hematology. Philadelphia ed. 2004, 1777-1795.

Sifilisul este o boala infectioasa si contagioasa determinata de Treponema pallidum, spirocheta patogena care se transmite prin contact sexual sau pe cale transplacentara, exceptional prin contact sanguin (intepatura, transfuzie)⁴. a. Aspecte clinice Dupa contact, agentul patogen difuzeaza rapid prin sistemul limfatic. Perioada de incubatie este cuprinsa intre 15 zile si 3 luni. In lipsa unei antibioterapii intercurente care sa “decapiteze” sifilisul, boala se instaleaza progresiv si poate conduce la manifestari clinice variate, clasificate astfel: sifilis precoce (infectios) si sifilis tardiv (neinfectios). Fiecare din cele 2 stadii pot include urmatoarele forme clinice (vezi tabelul 1):

– sifilis primar, secundar si sifilisul latent precoce (in cadrul sifilisului precoce);

– sifilis latent tardiv si numeroasele forme de sifilis tertiar (in cadrul sifilisului tardiv)^2;3.

se manifesta clinic prin prezenta sancrului si a adenopatiilor. Sancrul poate persista intre 2 – 6 saptamani si poate regresa spontan in absenta unui tratament specific. Sifilisul secundar se manifesta clinic prin eruptie cutaneo-mucoasa (trunchi, fata, palme, plante) insotita uneori de manifestari ca: febra, artralgii, poliadenopatii, hepatita, uveita. Semnele clinice apar intre 6 saptamani si 6 luni de la debutul sancrului. Eruptia poate sa dureze de la cateva zile la cateva saptamani. In absenta unui tratament specific, eruptia poate surveni in mai multe faze, intrerupte de perioade asimptomatice pe parcursul unei perioade de 1-2 ani. De remarcat posibilitatea regresului spontan al eruptiei in lipsa tratamentului. Sifilisul latent precoce si sifilisul latent tardiv sunt stadii lipsite de semne clinice. Existenta acestor stadii clinice silentioase in cursul carora diagnosticul nu este posibil decat prin teste serologice, constituie o dificultate majora in depistarea bolii. Sifilisul tertiar se manifesta clinic prin determinari cutanate (gome), neurologice (tabes, paralizie generalizata), cardiovasculare (aortita sifilitica, anevrism de aorta, stenoza coronariana). Semnele apar intr-un interval de 4 – 40 ani de la sancrul initial. Cazurile de sifilis tertiar sunt rare in zilele noastre si mai ales in tarile industrializate unde populatia foloseste in mod frecvent tratament antibiotic intercurent^2;4. Sifilisul congenital. Riscul transmiterii transplacentare a infectiei cu Treponema pallidum a crescut interesul pentru depistarea bolii la femeile gravide. Interpretarea rezultatelor serologice la femeia gravida este complicata prin posibilitatea existentei unei reactii fals pozitive legata de sarcina. In aceste situatii, determinarea FTA-ABS IgM sau EIA-IgM permite diferentierea unui sifilis vechi cu anticorpi reziduali de un sifilis evolutiv. In transmiterea transplacentara a bolii exista urmatoarele posibilitati evolutive: manifestari septicemice care duc la moartea fatului, nastere prematura, leziuni neurologice observate tardiv^2;7

. De rutina, diagnosticul sifilisului se bazeaza pe metodele serologice care sunt disponibile in majoritatea laboratoarelor. Metodele directe (microscopia cu fond intunecat, imunofluorescenta, inocularea la animal) raman apanajul laboratoarelor  de specialitate. Raspunsul imun fata de infectie include producerea de anticorpi fata de o paleta larga de antigene, fiind implicati atat anticorpi nespecifici (anticardiolipina/reagine) cat si anticorpi specifici antitreponemici. Primul raspuns demonstrabil este reprezentat de anticorpii specifici antitreponemici de tip IgM, care pot fi detectati la sfarsitul celei de a 2-a saptamani de infectie; anticorpii antitreponemici de tip IgG apar mai tarziu, in saptamana a patra. Astfel, la debutul simptomatologiei clinice majoritatea pacientilor prezinta anticorpi IgM si IgG (vezi fig.1). Anticorpii nespecifici se pozitiveaza dupa aproximativ 4 saptamani de la contactul infectant. Tratamentul si infectia HIV asociata pot afecta raspunsul imun. Titrul anticorpilor nespecifici si cel al anticorpilor specifici IgM scade rapid dupa tratamentul adecvat in sifilisul precoce, dar anticorpii specifici IgG persista indefinit³. Tinand cont de particularitatile raspunsului imun, testele serologice pentru sifilis pot fi clasificate in 2 mari categorii:

Testele non-treponemice sunt rapide, usor de efectuat, au un cost redus si prezinta o sensibilitate foarte buna, in special in stadiul precoce al infectiei. Principalul lor dezavantaj este ca se asociaza cu o rata importanta de rezultate fals pozitive, in special la gravide (la aceasta categorie, aproximativ 28% din rezultatele pozitive pentru RPR pot fi biologic fals pozitive). Rezultatele pot fi exprimate calitativ sau semicantitativ; titrurile VDRL/RPR sunt crescute la pacientii cu infectie acuta, reinfectie sau reactivare a unei infectii din antecedente care nu a fost tratata adecvat. Aproximativ 72-84% din pacientii cu sifilis primar sau secundar prezinta o scadere de 4 ori a titrului VDRL/RPR, la 6 luni dupa incheierea unui tratament corect. Rata seroreversiei depinde de titrul pretratament si stadiul bolii. Indivizii care prezinta primul episod de infectie au sanse mai mari de seroreversie decat cei cu infectii repetate. Astfel, testele non-treponemice sunt utile nu numai pentru identificarea infectiei ci si pentru monitorizarea eficientei tratamentului. Testele treponemice sunt folosite pentru a confirma testele screening pozitive. Au o incidenta de rezultate fals pozitive mai scazuta decat testele reaginice. Nu sunt in general recomandate pentru screening-ul infectiei deoarece au sensibilitate mai redusa decat testele non-treponemice in primele 2-3 saptamani ale stadiului de sifilis primar. Acest tip de anticorpi persista toata viata; nu sunt utili in monitorizarea eficientei terapeutice. Testele imunoenzimatice EIA care folosesc antigene treponemice recombinate in placi cu godeuri pentru a detecta anticorpi IgG si IgM au o sensibilitate similara testelor non-treponemice si o specificitate echivalenta testelor TPHA si FTA-ABS. Din aceste motive, testele EIA pot reprezenta o alternativa eficienta la asocierea traditionala a testelor non-treponemice si treponemice, pentru diagnosticul definitiv al sifilisului. Testele EIA IgM sunt mai sensibile decat FTA-ABS IgM si pot fi folosite pentru diagnosticul sifilisului precoce sau congenital³. Sifilisul congenital. La nastere nou-nascutul are acelasi profil serologic ca al mamei de la care s-a facut transferul pasiv al IgG si care vor disparea in primele 3-6 luni la un copil neinfectat. Controlul serologic al copilului neinfectat se face cu scopul de a urmari scaderea progresiva a titrului anticorpilor. Pentru copilul infectat si tratat, anticorpii  antitreponemici persista mult timp si numai scaderea semnificativa a VDRL –ului permite urmarirea eficacitatii  tratamentului. Dozarea IgM la nou-nascut, face  diferentierea intre pasajul pasiv de anticorpi materni (IgG) si sinteza activa de IgM de catre nou-nascut. Un profil serologic cu IgM negativ nu exclude diagnosticul de sifilis congenital, daca mama a fost infectata tardiv in cursul sarcinii^3;7. Serodiagnosticul la gravide Asa cum s-a mentionat mai sus, testele non-treponemice sunt asociate cu o rata semnificativa de rezultate fals pozitive, in special in prezenta unor titruri scazute. De aceea, in zonele cu prevalenta mare a infectiei unde accesul la testele de confirmare este limitat, gravidele care prezinta un titru ≥ 8 trebuie obligatoriu sa primeasca tratament. Cu toate acestea, avand in vedere morbiditatea si mortalitatea asociate cu infectia congenitala si  lipsa de acces in multe zone la teste RPR cantitative, se recomanda ca toate gravidele care prezinta un rezultat pozitiv la testele non-treponemice sau treponemice sa fie tratate imediat. Riscurile asociate cu un sifilis netratat in perioada sarcinii depasesc cu mult riscul tratamentului nenecesar la mamele cu un rezultat fals-pozitiv⁷. Sifilisul si infectia HIV La majoritatea pacientilor HIV pozitivi raspunsul serologic pentru infectia cu Treponema pallidum este nemodificat. Sunt rare cazurile in care s-au raportat reactii negative  sau slab pozitive pentru un pacient cu sifilis secundar⁵. Recomandari pentru determinarea serologiei sifilis 

– à jeun (pe nemancate)⁶.  Specimen recoltat – sange venos⁶. Recipient de recoltare – vacutainer fara anticoagulant cu/fara gel separator⁶.   Prelucrare necesara dupa recoltare – se separa serul prin centrifugare; determinarea se executa imediat; daca acest  lucru nu este posibil, serul se stocheaza la 2-8ºC⁶. Volum proba – minim 1 mL ser⁶. Cauze de respingere a probei – specimen hemolizat, lipemic sau contaminat bacterian⁶. Stabilitate proba – serul separat este stabil: 7 zile la 2-8°C si timp indelungat la – 20°C⁶.  Metoda de lucru Pot fi folosite doua categorii de metode de lucru: I. METODE CLASICE

A.   RPR (METODA IMUNOTURBIDIMETRICA)

      ● Particulele de polistiren latex captusite cu antigene lipidice (cardiolipina si lecitina) reactioneaza cu anticorpii de tip reaginic din serul pacientului formand aglutinate; aglutinarea induce cresterea turbiditatii amestecului de reactie care poate fi masurata ca absorbanta la 700 nm cu ajutorul unui fotometru; titrul reaginelor poate fi determinat prin masurarea turbiditatii la doua momente diferite, dupa initierea reactiei.

      ● Reactie cantitativa.

B.    ANTICORPI TOTALI ANTI-TREPONEMA PALLIDUM (METODA IMUNOCHIMICA CU  DETECTIE PRIN ELECTROCHEMILUMINISCENTA – ECLIA)

      ● Intr-o prima etapa serul pacientului este incubat cu antigene recombinante biotinilate   specifice pentru Treponema pallidum si cu antigene recombinante specifice pentru Treponema pallidum marcate cu un complex de ruteniu rezultand un complex „sandwich”; dupa adaugarea microparticulelor captusite cu streptavidina complexul se va lega de faza solida ca urmare a interactiunii streptavidina-biotina; amestecul de reactie va fi aspirat in celula de masurare unde microparticulele vor fi captate magnetic pe suprafata electrodului; aplicarea unui voltaj asupra electrodului va genera un semnal chemiluminiscent care va fi masurat de catre fotomultiplicator; rezultatul va fi determinat automat prin compararea semnalului electrochemiluminiscent obtinut de produsul de reactie al probei cu semnalul valorii cut-off obtinut anterior prin calibrare.

    ● Reactie semicantitativa.

A. Pentru VDRL/RPR:

negativ (-)

pozitiv  (de la  + la ++++)

Daca se efectueaza un test semicantitativ, se va comunica impreuna cu intensitatea reactiei si titrul corespunzator ultimei dilutii care a indicat un rezultat pozitiv.

B. Pentru TPHA:

negativ (-)

echivoc

pozitiv (de + la ++++).

A. Pentru RPR

       ● rezultatul se exprima in R.U. (unitati RPR); 1 R.U. corespunde unui titru RPR 1/1 la reactia clasica.

       ● negativ: <1 R.U.

       ● limita de detectie: 0.4 R.U.

In cazul obtinerii unui rezultat pozitiv analizorul repeta automat determinarile folosind o dilutie standard 1/8. In situatia in care titrul anticorpilor este foarte mare se efectueaza dilutii manuale.

B.  Pentru Anticorpii anti-Treponema pallidum

       ● rezultatul se exprima sub forma unui index

       ● negativ: <1; pozitiv: ≥1.

Un rezultat pozitiv la oricare din cele 2 teste este verificat si prin metoda clasica; in cazul in care se foloseste numai metoda clasica, un rezultat pozitiv va fi confirmat cu o a doua trusa de reactivi. In cazul in care se obtin rezultate discordante se va solicita repetarea recoltarii probei⁶.

Un algoritm simplu pentru diagnosticul de sifilis se face pornind de la VDRL si TPHA. (teste care se efectueaza in laboratoarele Synevo) VDRL = negativ; TPHA = negativ

–   serologie negativa       

–  rezultatul nu exclude un diagnostic de sifilis la debut; in caz de suspiciune clinica se recomanda repetarea serologiei peste 2 saptamani sau efectuarea FTA-ABS IgM sau  EIA IgM care se pot pozitiva precoce.

–   infectie veche tratata 

–   eventual ar mai putea fi vorba de un sifilis intr-o faza foarte timpurie: in caz de suspiciune clinica se recomanda repetarea serologiei peste 2 saptamani sau efectuarea FTA-ABS IgM sau  EIA IgM; 

–   alte posibilitati: reactie fals pozitiva la TPHA, sifilisul latent tardiv la care diagnosticul este uneori dificil, reactii incrucisate cu treponematozele non veneriene (pian, bejel, pinta) la pacientii originari din zone endemice. 

 VDRL = pozitiv; TPHA = pozitiv

–   sifilis recent sau vechi, netratat sau tratat tarziu 

Nota: in sifilisul primar valorile sunt slab pozitive, in cel secundar, titrul anticorpilor este crescut. In absenta semnelor clinice, un  nivel  la limita al anticorpilor face dificila interpretarea serologica. Se pune problema unui sifilis latent precoce sau a unui tratament antibiotic urmat de pacient. La pacientii tratati tardiv, serologia poate ramane pozitiva, dar urmarirea in dinamica a titrului anticorpilor cu diminuarea semnificativa a VDRL –ului ajuta la stabilirea diagnosticului. VDRL = pozitiv; TPHA = negativ

–   in cazul unui VDRL intens pozitiv, este cel mai probabil  vorba de un rezultat biologic fals pozitiv (se pune adesea problema existentei anticorpilor anticardiolipinici); oricum se recomanda repetarea serologiei peste 2-3 saptamani (eventual determinari cantitative in dinamica)

–    in cazul unui VDRL slab pozitiv se recomanda efectuarea FTA-ABS; daca acest test este negativ este vorba de un rezultat biologic fals pozitiv; daca testul este pozitiv poate fi vorba de un sifilis precoce si in acest caz se recomanda repetarea serologiei peste 2-3 saptamani (profilul serologic cel mai frecvent intalnit in sifilisul primar este VDRL + ,TPHA +; foarte rar, in stadii precoce ale sifilisului primar, TPHA este negativ, FTA-ABS fiind pozitiv)^8;9.

Reactii fals pozitive:

Serurile puternic lipemice (lactescente) pot influenta testul. B. Pentru TPHA: Reactii fals pozitive:

Serurile puternic lipemice (lactescente) pot influenta testul. Pentru serurile pozitive sau echivoce se recomanda efectuarea reactiei FTA – ABS care permit diferentierea anticorpilor IgM de cei IgG^1;3;6. In cazul determinarii anticorpilor anti-Treponema pallidum prin ECLIA, pot produce interferente cu unele componente ale kit-ului si conduce la rezultate neconcludente urmatoarele: – tratamentul cu biotina in doze mari (>5 mg/zi); de aceea se recomanda ca recoltarea de sange sa se faca dupa minimum 8 ore de la ultima administrare; – titrurile foarte crescute de anticorpi anti-streptavidina si anti-ruteniu⁶.   Bibliografie 1. Dieusaert Pascal, Guide Practique des Analyses Médicales, Éditions Maloine, 2002, 973-977 2. Dupin N., Syphilis- Aspects cliniques, BEH 2001, 35-36: 170-172 3. Egglestone SI, Turner AJL. Serological diagnosis of syphilis. In Commun Dos. Public Health 2000, 3: 158-62. 4. Harrison. Sifilisul. In Principiile medicinei interne, Editia a 13-a, vol.I, Ed.Teora, 1998, 809-821 5. Janier M., Chasrang C., Spindler E. et al. A prospective study of the influence of HIV status on the seroconversion of serological tests for syphilis. In Dermatology, 1999; 198: 362-369. 6. Laborator Synevo. Referinte specifice tehnologiei de lucru utilizate 2015. Ref Type: Catalog 7. Rosanna W. Peeling et.al. Maternal and Congenital Syphilis. In Bulletin of the World Health Organization, June 2004, 82 (6) 8. Results Interpretation for Syphilis Serology. University Hygienic Laboratory. Communication www.esculape.com/fmc/syphilis.html Ref Type: Internet

La indivizii sanatosi, dupa administrarea orala a unei cantitati mari de glucoza raspunsul insulinic apare rapid, atingand un maximum dupa circa 30-60 minute. Atunci cand exista o cantitate suficienta de insulina pentru a metaboliza glucoza administrata la inceputul testului, concentratiile de glucoza revin la normal in aproximativ 3 ore³. Eliberarea insuficienta de insulina sau rezistenta periferica la actiunile insulinei va determina o crestere semnificativa a glicemiei¹. Daca se obtin valori modificate pentru glicemia bazala (à jeun) sau postprandiala, acest test poate sustine sau infirma diagnosticul de diabet zaharat³. Recomandari pentru efectuarea testului de toleranta la glucoza – pacienti cu glicemie bazala modificata (impaired fasting glucose, IFG); antecedente familiale de diabet zaharat; obezitate; istoric de infectii recurente (cutanate sau urinare); episoade inexplicabile de hipoglicemie; paciente cu avorturi spontane, nasteri premature, nasteri de feti morti sau macrosomi; glicozurie tranzitorie sau hiperglicemie in cursul sarcinii, dupa interventii chirurgicale, traumatisme, stres, infarct miocardic sau administrare de ACTH³. Contraindicatiile testului  Testul nu trebuie efectuat la pacientii cu paralizie hipokaliemica periodica¹. De asemenea testul nu este indicat in caz de: hiperglicemie bazala  ≥ 126 mg/dL la doua determinari; valori ale glicemiei bazale constant normale; valori ale glicemiei  postprandiale ≥200mg/dL la doua determinari; diabet zaharat clinic manifest; diabet secundar (ex. dupa administrare de hormoni)³. Pregatirea pacientului  Ultimul consum de alimente trebuie sa fie cu cel putin 8 ore (nu mai mult de 16 ore¹) inaintea efectuarii testului; este permisa ingestia unor cantitati mici de apa. Pacientul trebuie sa aiba o dieta normala in ultimele 72 ore (>150g glucide/zi si abstinenta de la alcool)^1;4. Este interzis fumatul si efortul fizic pe durata efectuarii testului³. Efectuarea testului Va rugam verificati in laboratorul Synevo din orasul dumneavoastra conditiile de efectuare ale acestui test. Adulti: Se vor administra in interval de 5 minute 75g glucoza anhidra dizolvata in apa rece. Copii: Cantitatea de glucoza administrata este in functie de greutatea pacientului: 1.75g/kg corp – maximum 75g. Se vor recolta 2 probe de sange: imediat inainte de administrarea glucozei si dupa 120 minute^1;4. In anumite situatii clinice, la solicitarea medicului, se pot recolta mai multe probe la: 30, 60, 90, 120, 180 minute⁴. Reactii adverse: unele persoane pot prezenta greata sau pot avea simptome vaso-vagale in cursul efectuarii testului¹.  Interpretarea rezultatelor Interpretarea valorilor glicemiei bazale si in cadrul testului de toleranta la glucoza se efectueaza conform criteriilor ADA (American Diabetes Association):

Pentru diagnosticul de diabet zaharat sunt necesare cel putin doua valori anormale ale testului de toleranta la glucoza. Testul de toleranta la glucoza este util nu numai in diagnosticul diabetului zaharat, ci si in identificarea pacientilor cu intoleranta la glucoza (impaired glucose tolerance, IGT). Persoanele cu IFG, ca si cele cu cele cu IGT, fac parte dintr-un grup intermediar, care, desi nu indeplineste criteriile de diagnostic ale diabetului zaharat, prezinta niveluri ale glucozei prea mari pentru a fi considerate normale. Acestea persoane au fost incadrate anterior ca avand „prediabet”. Conform noilor recomandari ADA (2010), IFG si IGT nu trebuie considerate entitati clinice de sine-statoare, ci mai degraba categorii de risc crescut pentru diabet si afectiuni cardiovasculare. IFG si IGT se asociaza cu obezitate (in special abdominala), hipertensiune arteriala si dislipidemie (trigliceride crescute si HDL-colesterol scazut). Cresterea activitatii fizice, scaderea ponderala si administrarea anumitor agenti farmacologici previn sau intarzie dezvoltarea diabetului la persoanele cu intoleranta la glucoza⁶. Alte conditii clinice asociate cu modificarea tolerantei la glucoza:

• Scaderea tolerantei la glucoza cu valori crescute ale glicemiei poate aparea: postgastrectomie, in ingestia excesiva de glucoza, hiperlipidemie tipurile III, IV si V, hemocromatoza, boala Cushing, leziuni SNC.

• Scaderea tolerantei la glucoza cu hipoglicemie poate aparea in: boala von Gierke, boli hepatice severe, niveluri crescute de epinefrina.

• Cresterea tolerantei la glucoza cu aplatizarea curbei (obtinuta din valorile glicemiei la 30, 60, 90, 120, 180 minute) poate aparea in: hiperplazie sau tumori ale celulelor insulare pancreatice, malabsorbtie (sprue, boala celiaca, boala Whipple), boala Addison, hipopituitarism, hipoparatiroidism, hipotiroidie, boli hepatice¹.

Testul are valoare limitata in diagnosticul diabetului zaharat la copii si este rar indicat in acest scop. Fumatul poate creste nivelurile de glucoza. Dieta alterata (ex. regim pentru scaderea in greutate) poate scadea toleranta la glucoza si sugera un “fals diabet”. Bolile infectioase si interventiile chirurgicale pot afecta toleranta la glucoza, de aceea testul se recomanda a fi efectuat la un interval de 2 saptamani de la episodul acut. Repausul prelungit la pat poate de asemenea sa afecteze rezultatele testului; atat cat este posibil, testul se va efectua doar la pacienti ambulatori. Alte conditii patologice care pot genera rezultate fals patologice la testul de toleranta la glucoza: ulcer duodenal, gastrectomie, hipokaliemie, hipermagneziemie⁵. • Medicamente

Cresterea tolerantei la glucoza: atenolol, clofibrat, gliburid, fenitoin, guanetidina, lisinopril, inhibitori MAO, metformin, metoprolol, nandrolol, octreotid, prazosin².

Scaderea tolerantei la glucoza: acebutolol, acid nicotinic, atenolol, betametazona, calcitonina, clorpromazina, clofibrat, contraceptive orale, estrogeni conjugati, cortizon, danazol, dexametazona, diazoxid, dietilstilbestrol, foscarnet, furosemid, hormon de crestere, hidroclorotiaziad, imipramina, interferon alfa-2a, litiu, medroxiprogesteron, metilprednisolon, metoprolol, naproxen, niacinamida, nifedipin, pindolol, prednisolon, prednison, prometazina, spironolactona, streptozocin, triamcinolon, triamteren, verapamil².

Daca este posibil, medicatia trebuie intrerupta cu cel putin 3 zile inainte de test (in special contraceptive orale, diuretice tiazidice, corticosteroizi, fenotiazine)³.   Bibliografie 1. Frances Fischbach. Chemistry studies. In A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 8 Ed. 2009, 352-356. 2. Frances Fischbach. Effects of the Most Commonly Used Drugs on Frequently Ordered Laboratory Tests. In A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 8 Ed. 2009, 1241. 3. Julian H Barth, Garry E Butker, Peter Hammond. Glucose Tolerance Test for Diabetes Mellitus. In Biochemical Investigations in Laboratory Medicine. Association of Clinical Biochemists, London, 2001, 146-147. 4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog. 5. Lothar Thomas. Oral Glocose Tolerance Test. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany, 1 Ed. 1998, 140-142. 6. Standards of Medical Care in Diabetes – 2010. American Diabetes Association.