Page 94 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 1

5 METODE DE LUCRU GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE
AL LABORATOARELOR SYNEVO

indică faptul că infecţia a fost dobândită în urmă cu cel puţin 4 luni, în timp ce obţinerea unui indice de
aviditate scăzută sugerează posibilitatea unei infecţii recente .
3
Teste imunochimice cu detecţie prin chemiluminiscenţă (CLIA) se bazează pe utilizarea unor unor
antigene legate de microparticule magnetice (faza solidă) şi a unor conjugate de anticorpi marcaţi cu
un derivat de isoluminol care sunt incubate împreună cu serurile de analizat. Prin adăugarea reactivilor
starter este indusă o reacţie de chemiluminiscenţă; semnalul luminos (şi implicit cantitatea de conjugat
isoluminol-anticorp) este măsurat în unităţi optice relative (RLU) cu ajutorul unui fotomultiplicator şi
este proporţional cu cantitatea de anticorpi din probă.
Metoda CLIA este aplicată în laboratorul nostru la detectarea anticorpilor specifici faţă de virusurile
herpetice HSV1,2 şi pentru anticorpii anti-Borrelia IgG şi IgM .
2
Teste imunochimice cu detecţie prin electrochemiluminiscenţă se bazează pe utilizarea unui
complex al ruteniu (II)-tris(bipiridil) [Ru(bpy) ] cu tripropilamina (TPA) care generează lumina
2+
3
electrochimic în legătură cu un ciclu de reacţie oxido-reducător: Ru(bpy) are un situs reactiv pentru
2+
3
conjugarea cu analitul; este utilizat un agent activator, cum ar fi N-hidroxisuccinimid (NHS), deoarece
poate fi mai uşor cuplat cu grupuri amino ale proteinelor, haptenelor sau acizilor nucleici, ceea ce face
posibilă aplicarea tehnologiei la o gamă variată de analiţi. Emisia de lumină este iniţiată electric prin
aplicarea unui voltaj complexului imun (care include complexul de Ru) ataşat la microparticule învelite
în streptavidină. Avantajul iniţierii electrice a reacţiei chemiluminiscente este ca întreaga reacţie poate
fi precis controlată. Sunt disponibile trei principii ale metodei:
- principiul “sandwich”: iniţial proba pacientului este mixată cu Ac cuplaţi cu biotină şi Ac marcaţi
cu Ru (conjugat); după incubarea amestecului se adaugă microparticulele paramagnetice
învelite în streptavidină (faza solidă); după cea de a doua incubare amestecul de reacţie este
aspirat în celula de măsurat, iar conjugatul liber este îndepărtat; în continuare se foloseşte
curentul electric pentru a excita ruteniul şi a genera semnalul care va permite detecţia
complexelor Ag-Ac; cantitatea de lumină produsă este direct proporţională cu cantitatea de
Ag din probă; (vezi fig.5.3.3 care ilustrează etapele de determinare a tiroglobulinei)
- principiul competitiv: iniţial sunt mixate specimenul de analizat şi Ag cuplat cu biotina; după
prima incubare se adaugă Ac conjugaţi cu complexul de Ru şi microparticulele paramagnetice
învelite în streptavidină; Ac conjugaţi se cuplează cu situsurile încă neocupate ale Ag
biotinilat, iar întregul complex se leagă de microparticule prin interacţiunea biotinei cu
streptavidină; după a doua incubare amestecul de reacţie este trecut în celula de măsurare;
complexele imune sunt imobilizate magnetic pe suprafaţa electrodului, iar componentele
nelegate sunt îndepărtate prin spălare; reacţia chemiluminiscentă este stimulată electric,
iar cantitatea de lumină produsă este invers proporţională cu concentraţia de Ag din probă
(vezi fig.5.3.4 care ilustrează etapele de determinare a anticorpilor anti-tiroglobulină);
- principiul “bridging” este similar principiului “sandwich”, dar este destinat detecţiei de Ac şi
include Ag biotinilat şi Ag marcat cu Ru .
2;4

94