Page 99 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 1

GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE 5
AL LABORATOARELOR SYNEVO METODE DE LUCRU

trebui să fie din nou decomplementat prin incubare 10 minute la 56ºC.
În laboratorul Synevo, RFC se efectuează pe un analizor automat şi se aplică la următoarele teste:
serologie Coxiella burnetii, leptospire şi Listeria monocytogenes. Reactivii liofilizaţi sunt incluşi în
godeuri plasate într-un strip, care după pipetarea serului va fi introdus în analizor. La fiecare rulare a
probelor este folosit un ser de control .
1
Tehnica de imunofluorescenţă indirectă
Testele de imunofluorescenţă combină tehnicile histologice cu cele imunologice şi sunt împărţite în
două categorii:
- teste de imunofluorescenţă directă: detectează antigene celulare sau tisulare cu ajutorul
unor anticorpi specifici marcaţi cu fluoresceină; secţiunile tisulare sunt fixate pe lame
microscopice; se adaugă anticorpii specifici conjugaţi cu fluoresceină după care urmează
o perioadă de incubare; după îndepărtarea anticorpilor în exces se evaluează microscopic
prezenţa imunofluorescenţei celulare specifice;
- teste de imunofluorescenţă indirectă: detectează anticorpi serici îndreptaţi împotriva unor
celule sau microrganisme; sursa antigenică este reprezentată de secţiuni tisulare sau de
celule dezvoltate în culturi; se adaugă serul diluat al pacientului, după care urmează o
perioadă de incubare; după îndepărtarea excesului de proteine serice se adaugă reactivul
de detecţie reprezentat de imunoglobuline polivalente anti-IgG umane conjugate cu
fluoresceină; după îndepărtarea excesului de conjugat se evaluează microscopic prezenţa
imunofluorescenţei celulare specifice.
Tehnica imunofluorescenţei indirecte este aplicată în laboratorul nostru la detectarea anticorpilor
anti-nucleari (ANA), anti-citoplasmă neutrofile (ANCA), anti-neuronali, anti-glicoproteină asociată
mielinei (MAG), anti-celule parietale gastrice, anti-endomisium, anti-Saccharomyces
cerevisiae (ASCA), anti-acini pancreatici, anti-enterocit, anti-desmozomali (pemfigus), anti-
membrană bazală epidermică (pemfigoid), anti-Bartonella henselae etc.

Tehnica Imunoblot (Western blot)
Constituie o metodă foarte sensibilă de vizualizare a unor proteine specifice într-un amestec complex
de antigene. Reacţia se desfăşoară în următoarele etape secvenţiale (vezi fig. 5.4.1):
- separarea proteinelor prin electroforeză în gel de poliacrilamidă sau agaroză în prezenţă de
sodium dodecil sulfat (SDS) sau uree;
- transferul proteinelor din mediul electroforetic pe o fază solidă reprezentată de o membrană
de nitroceluloză sau de nylon; faza solidă trebuie să imobilizeze proteinele fără a permite
difuzarea acestora; metoda electroforetică (electroblotting) este cea mai eficientă metodă
de transfer;
- blocarea situsurilor de legare nespecifică din faza solidă după transferul proteinelor urmată
de spălarea matricei şi tăierea acesteia în fâşii (strip-uri);
- detecţia benzilor corespunzătoare proteinelor cu ajutorul unor anticorpi marcaţi cu enzime.
Un exemplu de aplicaţie a acestei tehnici în laboratorul nostru este detectarea anticorpilor specifici
faţă de virusul hepatitei C (anti-HCV confirmare): probele diluate sunt incubate împreună cu strip-ul
încărcat cu antigene HCV obţinute prin recombinare; dacă în ser sunt prezenţi anticorpi specifici

99