int(0)

Teste de laborator

Pachete de analize medicale

Planșa anatomică

Teste de la A la Z A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z
Teste Laborator
Product categories
Pachete analize Plansa anatomica
< inapoi la lista

Anticorpi ENA-Blot (SS-A, SS-B, RNP, Scl-70, Jo-1, Sm)

Pret 850.00 MDL

Системные аутоиммунные заболевания характеризуются наличием повышенных титров аутоантител к внутриклеточным белкам и нуклеиновым кислотам. Эти аутоантитела обычно называют антиядерными антителами (ANA), потому что они преимущественно направлены против ядерных антигенов, но они также включают антицитоплазматические антитела.
Обнаружение ANA является высокочувствительным, поэтому считается лучшим скрининговым тестом на системные ревматические заболевания. Распространенность АНА при этих заболеваниях составляет от 20 до 100%. Для выявления ревматических заболеваний очень важно дифференцировать ANA 1; 5; 6. Таким образом, в настоящее время описаны две основные категории антиядерных антител:
Аутоантитела, которые нацелены на ДНК и гистоны в качестве антигенной мишени;
Аутоантитела, нацеленные на растворимые ядерные антигены (ENA).
Название ENA происходит от того факта, что эти антигены первоначально были извлечены из солевых ядер. Первые идентифицированные антитела к ENA были направлены против антигена Смита (Sm, 1966); Впоследствии были описаны другие подтипы ENA, в которые они были включены вместе с ядерными антигенами и растворимыми цитоплазматическими компонентами. Основными антигенами, используемыми в настоящее время в иммунологических лабораториях, являются: рибонуклеопротеины (RNP), Sm, SS-A / Ro, SS-B / La, Sc1-70 и Jo-1. Хотя большинство антител против ENA имеют специфические ассоциации с определенными заболеваниями, иногда могут быть значительные совпадения 7.
Антитела против U1nRNP и Sm направлены против антигенов, принадлежащих к небольшой группе рибонуклеопротеинов (snRNP). Это комплексы, состоящие из РНК с высоким содержанием уридина (U-РНК) и различных белков с молекулярной массой 9-70 кДа. Хроматография выявила 5 типов У-РНК: U1, U2, U4, U5 и U6. Частицы U-nRNP содержат 6 основных или Sm белков (B, B ‘, D, E, F, G), а U1-RNP дополнительно содержит специфические белки (70K, A, C). Таким образом, анти-U1 RNP-антитела реагируют с одним или несколькими специфическими белками, тогда как анти-Sm-антитела реагируют с одним или несколькими коровыми белками. Действие snRNP необходимо для удаления интронов из пред-РНК мессенджера (процесс сплайсинга), в результате чего мРНК будет экспортироваться из ядра и участвовать в процессе трансляции белков из рибосом.
Повышенные титры анти-U1 RNP-антител обнаруживаются с 95-100% распространенностью при заболевании смешанной соединительной ткани (синдром Шарпа), что является одним из диагностических критериев для этого состояния. Титр антител также коррелирует со степенью активности заболевания. Антитела против RNP против U1 также могут быть обнаружены у пациентов с СКВ (15-40%), системным склерозом и полимиозитом 1; 3.
Антитела против Sm направлены против антигена Sm, названного в честь первого идентифицированного пациента (Стефани Смит). Sm-антиген является частью группы snRNP, вовлеченной в процесс сплайсинга РНК-мессенджера. Антитела против Sm обнаруживаются у 5-40% пациентов с СКВ с высокой специфичностью (более 90%) к волчанке. Вместе с двухцепочечными анти-ДНК-антителами они могут считаться патогномоничными для этого клинического состояния и являются частью диагностических критериев ACR для SLE 4.
Антитела против SS-A (Ro) направлены против антигена, который также принадлежит к группе небольших рибонуклеопротеинов (растворимое вещество А или антиген Роберта). Он состоит из молекулы РНК (Y1, Y2, Y3, Y4 или Y5) и белка 60 кДа. Комплекс также может связать 52 кДа белок (Ro52), но это все еще спорным в литературе. Различные исследования показали, что SS-A-позитивные сыворотки всегда содержат антитела против нативного белка SS-A 60 кДа и могут дополнительно иметь антитела, направленные против белка Ro52. Дифференциация от антител против Ro52 имеет диагностическое значение, поскольку они неспецифичны и могут быть обнаружены в различных условиях.
Антитела против SS-A связаны с различными аутоиммунными заболеваниями: синдром Шегрена (40-95% случаев), СКВ (20-60%), первичный билиарный цирроз (20%). Следует отметить, что эти аутоантитела встречаются в 100% случаев волчанки новорожденных. Их также можно обнаружить при аутоиммунном или вирусном гепатите.
Антитела против SS-B (La) направлены против белка, который играет роль в транскрипции РНК-полимеразы III (растворимое вещество B или антиген Лейна). La, вероятно, является фактором завершения транскрипции, который связывается с 3’-концом вновь созданных продуктов транскрипции РНК-полимеразы III. Антитела против SS-B обычно встречаются в сочетании с антителами против SS-A и связаны с такими же клиническими состояниями1; 6; 7.
Анти-Ro52s направлены против антигена 52 кДа и были описаны как неспецифические аутоантитела, связанные как с ревматическими, так и с неревматическими заболеваниями. Они на 100% присутствуют у матерей плодов или новорожденных с врожденной атриовентрикулярной блокадой или волчанкой новорожденных 1.
Антитела против Scl-70 направлены против негистонового белка 70 кДа, первоначально выделенного из ядер клеток печени крысы. Впоследствии было показано, что этот белок является деградирующим продуктом ДНК топоизомеразы I, класса ферментов, расположенных в нуклеоплазме и ядрышках, обладающих функцией поддержания информационной целостности ДНК (благодаря способности расщеплять и объединять один из две нити ДНК).
Антитела против Scl-70 обнаруживаются у 40% пациентов с диффузным системным склерозом и у 10% пациентов с ограниченным системным склерозом, что является неблагоприятным прогностическим фактором.

Антитела против Jo-1 направлены против фермента гистидил-т-РНК-синтетазы. In vitro эти аутоантитела связываются с конформационными эпитопами фермента и ингибируют его каталитическую активность. Антиген находится в димерной форме и находится в цитоплазме; Молекулярная масса субъединиц составляет 50 кДа. Антитела против Jo-1 являются серологическим маркером дерматомиозита / полимиозита, распространенность которого составляет 20-40%. Присутствие этих аутоантител связано с более тяжелой формой заболевания, плохим прогнозом и более частыми рецидивами. Аутоантитела могут быть обнаружены на ранней стадии, иногда до появления симптомов. У детей анти-Jo-1 антитела встречаются крайне редко 1; 3; 6; 7.
Рекомендации по определению антител к ENA BLOT – оценка пациентов с положительным тестом ANA IIF (непрямой иммунофлуоресценции) и клиническими признаками, указывающими на системное ревматическое заболевание. Как правило, не рекомендуется проводить ANA при наличии отрицательного результата АНА IIF, если только у пациента нет явных клинических признаков ревматического заболевания и особенно синдрома Шегрена или полимиозит (тест АNА иногда может быть отрицательным в присутствии антител к высокорастворимым антигенам, таким как будет SS-A / Ro или против цитоплазматических антигенов, недостаточно экспрессируемых на препаратах Hep-2 или других тканях, таких как Jo-1) 5.
Подготовка пациента – натощак или после еды 2.
Материал – венозная кровь 2.
Транспортная среда, пробирка – вакуумный без антикоагулянта с / без разделительного геля 2.
Необходимая обработка после сбора материала – отделение сыворотки центрифугированием 2.
Объем образца – минимум 0,5 мл сыворотки 2.
Причины отказа от пробы – сильно гемолизированная сыворотка, липемическая или загрязненная бактериями 2.
Стабильность образца – отделенная сыворотка стабильна в течение 14 дней при 4 ° С; более длительное время при -20 ° С 2.
Метод – иммуноблот. В анализе используются 7 очищенных нативных и рекомбинантных антигенов, которые закреплены в параллельных чипах на мембране полоски. Антигены представлены в порядке фиксации на полоске:
– nRNP / Sm: очищенный нативный антиген
– Sm: очищенный нативный антиген
– SS-A: очищенный нативный антиген
– Ro 52: рекомбинантный антиген
– SS-B :: очищенный нативный антиген
– Scl-70: очищенный нативный антиген
– Jo-1: очищенный нативный антиген
На первом этапе полоску, загруженную очищенными антигенами, инкубируют вместе с разведенной сывороткой пациента. Если в сыворотке присутствуют специфические антитела, они будут связываться с соответствующими антигенами на полоске. После стадии промывания полоску инкубируют с меченным щелочной фосфатазой человеческим анти-IgG-конъюгатом. Конъюгат будет прикрепляться к части IgG комплекса антиген-антитело. После промывки путем удаления несвязанного конъюгата добавляют окрашивающий раствор (субстрат фермента) – колориметрическую систему обнаружения фермента. Если присутствует связанный конъюгат, ферментативная реакция будет генерировать продукт темно-синего цвета в полосах, занятых специфическими антителами. Таким образом, полосы, визуализируемые на полоске, являются результатом связывания специфических антител с отдельными антигенами на полоске.
На каждой полосе имеется внутренняя контрольная полоса. Появление интенсивной цветовой реакции на этом уровне свидетельствует о том, что все этапы теста иммуноблота были выполнены правильно.
Ориентиры и интерпретация результатов
Окончательная интерпретация результатов теста выполняется с помощью программного обеспечения (после сканирования полос), которое в зависимости от интенсивности сигнала дает оценку для каждой полосы полосы следующим образом:
Нет группы 0-5 0 ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ
Слабая полоса 6-10 (+) Cомнительный
Средняя интенсивность 11-25 или 26-50+, ++ ПОЗИТИВНО
Очень интенсивная группа > 50 +++ ИНТЕНСИВНЫЙ ПОЗИТИВ

Наконец, подсчитывается сумма присужденных баллов и генерируется результат теста.
Положительный результат подтверждает наличие специфических антител.
Неоднозначный результат указывает на то, что присутствие аутоантител является неопределенным; В зависимости от клинического контекста пациента, тест будет повторяться каждые 1-2 месяца.
Отрицательный результат указывает на отсутствие специфических аутоантител 2.
Пределы и интерференция 2
– nRNP / Sm: отрицательный
– Sm: отрицательный
– SS-A: отрицательный
– Ro 52: отрицательный
– SS-B: отрицательный
– Scl-70: отрицательный
– Джо-1: отрицательный.
Библиография
1. Carlos Alberto von Mühlen, Robert M. Nakamura. Clinical and laboratory Evaluation of Systemic Rheumatic Diseases. In Henry´s
Clinical Diagnosis and Management By Laboratory Methods, Ed.Saunders, 2007, 924-928.
2. Лаборатория Synevo. Конкретные ссылки на технологии работы использованы 2012. Ref Type: Catalog.
3. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Antinuclear Antibodies. www.labcorp.com 2012. Ref Type: Internet Communication.
4. Soto ME, et al. Gender impact in systemic lupus erythematosus. In Clin Exp Rheumatol 22 (2004), 713-721.
5. Tozzoli et al. Guidelines for the Laboratory Use of Autoantibody Tests in the Diagnosis and Monitoring of Autoimmune Rheumatic Diiseases. In Am Clin J Pathol 2002, 117, 316-324.
6. van Venrooji WJ et al. The consensus workshop for the detection of autoantibodies to intracellular antigens in rheumatic diseases. In J Immunol Methods 5 (1991), 181-189.
7. Yashwant Kumar et al. Antinuclear antibodies and their detection methods in diagnosis of connective tissue diseases: a journey revisited. In Diagnostic Pathology, 2009, 4:1.

SKU: IM281

Informații generale

Bolile autoimune sistemice se caracterizează prin prezența în titruri crescute a autoanticorpilor față de proteine intracelulare și acizi nucleici. Acești autoanticorpi sunt denumiți generic anticorpi antinucleari (ANA) datorită faptului sunt îndreptați predominant împotriva antigenelor nucleare, dar ei includ și anticorpi anticitoplasmatici.

Detectarea ANA are o mare sensibilitate, de aceea este considerat cel mai bun test de screening pentru bolile reumatice sistemice. Prevalența ANA în aceste afecțiuni se situează între 20 și 100%. Pentru identificarea bolilor reumatismale este  foarte importantă diferențierea ANA1;5;6. Astfel, sunt descrise în prezent două categorii principale de anticorpi antinucleari:

  1. Autoanticorpi ce au drept țintă antigenică ADN-ul și histonele;
  2. Autoanticorpi ce au drept țintă antigene nucleare solubile (extractable nuclear antigens = ENA).

Denumirea ENA provine din faptul că aceste antigene au fost extrase inițial din nuclei cu soluție salină. Primii anticorpi ENA identificați au fost cei îndreptați împotriva antigenului Smith (Sm, 1966); ulterior au fost descrise și alte subtipuri ENA în care au fost incluse alături de antigenele nucleare și componente citoplasmatice solubile. Principalele antigene utilizate în mod curent în laboratoarele de imunologie sunt: ribonucleoproteine (RNP), Sm, SS-A /Ro, SS-B/La, Scl-70 și Jo-1. Deși cei mai mulți anticorpi  anti-ENA prezintă asocieri specifice cu anumite boli pot exista uneori suprapuneri semnificative7.

Anticorpii anti-U1nRNP și Sm sunt îndreptați împotriva  unor antigene care aparțin grupului de ribonucleoproteine mici (snRNP). Acestea sunt complexe formate din  ARN  cu un conținut înalt de uridină (U-RNA)  și diverse proteine având o greutate moleculară de 9-70 kDa. Prin cromatografie au fost puse în evidență 5 tipuri de U-RNA: U1, U2, U4, U5 și U6. Particulele de U-nRNP conțin 6 proteine core sau Sm (B, B’, D, E, F, G), iar U1-RNP conține în plus proteine  specifice (70K, A, C). Astfel, anticorpii anti – U1 RNP reacționează cu una sau mai  multe proteine specifice în timp ce anticorpii anti-Sm reacționează cu una sau mai multe proteine core. Acțiunea snRNP este esențială pentru eliminarea intronilor din pre-ARN-ul mesager (procesul de splicing), rezultând ARNm care va fi exportat din nucleu  și implicat in procesul de translație  a proteinelor de la nivelul ribozomilor.

Titruri crescute de anticorpi  anti-U1 RNP se  întâlnesc cu o prevalență de 95-100%  în boala mixtă de țesut conjunctiv (sindromul Sharp), constituind unul din criteriile de diagnostic al acestei afecțiuni. Titrul de anticorpi se corelează de asemenea cu gradul de activitate a bolii. Anticorpii anti-U1 RNP mai pot fi întâlniți și  la pacienti cu LES (15-40%), scleroză sistemică și polimiozită1;3.

Anticorpii anti-Sm  sunt îndreptați  asupra antigenului Sm, denumit astfel după primul pacient (Stephanie Smith) la care a fost pus în evidență. Antigenul Sm face parte din grupul snRNP implicate în procesul de splicing al ARN-ului mesager. Anticorpii anti-Sm sunt întâlniți la 5-40% din  pacienții cu LES având o specificitate înaltă (peste 90%) pentru boala lupică.  Împreună cu anticorpii anti-ADN dublu catenari pot fi considerați patognomonici pentru această condiție clinică și fac parte din criteriile ACR  de diagnostic al LES4.

Anticorpii anti-SS-A (Ro)sunt  îndreptați împotriva unui antigen care face parte tot din grupul  ribonucleoproteinelor mici (soluble substance A sau Robert antigen).  Acesta este compus dintr-o moleculă ARN (Y1, Y2, Y3, Y4 sau Y5) și o proteină de 60 kDa. Complexul poate asocia și o proteină de 52 kDa (Ro52) ,dar  acest lucru este încă controversat în literatura de specialitate. Diverse studii au arătat că serurile pozitive pentru SS-A conțin întotdeauna anticorpi împotriva proteinei native SS-A  de  60 kDa și adițional pot avea  și anticorpi îndreptați împotriva proteinei Ro52. Diferențierea de anticorpii anti-Ro52 are importanță diagnostică, deoarece aceștia  sunt nespecifici, putând fi detectați într-o multitudine de afecțiuni.

Anticorpii anti-SS-A sunt asociați cu diverse boli autoimune: Sindrom Sjögren (40-95% din  cazuri), LES (20-60%), ciroză biliară primitivă (20%). Trebuie menționat că acești autoanticorpi apar în 100% din cazurile de lupus  neonatal. Pot fi întâlniți de asemenea în hepatitele autoimune sau virale.

Anticorpii anti-SS-B (La)  sunt îndreptați împotriva unei proteine ce deține un rol în transcripția  ARN polimerazei III (soluble substance B sau Lane antigen). La reprezintă probabil un factor de finalizare a transcripției care se leagă de capătul 3′ al produșilor de transcripție nou-generați ai ARN polimerazei III. Anticorpii anti-SS-B apar de obicei împreună cu anti-SS-A, fiind asociați cu aceleași condiții clinice1;6;7.

Anti-Ro52 sunt îndreptați împotriva unui antigen de 52 kDa și au fost descriși ca autoanticorpi nespecifici asociați atât cu boli reumatice cât și non-reumatice. Sunt prezenți într-un procent de 100% la mamele feților sau nou-născuților cu bloc atrio-ventricular congenital sau lupus neonatal1.

Anticorpii anti-Scl-70 sunt îndreptați împotriva unei proteine non-histonice de 70 kDa, izolată inițial din nuclei de celule hepatice provenite de la șobolan. Ulterior, s-a demonstrat că această proteină este un produs de degradare al ADN topoizomerazei I, o clasă de enzime localizate în nucleoplasmă și nucleoli, având funcția de a menține integritatea informațională a ADN (prin  capacitatea de a scinda și de a reuni la loc unul din cele două lanțuri ADN).

Anticorpii anti-Scl-70 se găsesc la 40% din pacienții cu scleroză sistemică forma difuză și la 10% din pacienții cu scleroză sistemică forma limitată, fiind un element de prognostic nefavorabil.

Anticorpii anti-Jo-1 sunt îndreptați împotriva enzimei histidil-t-ARN sintetaza. In vitro acești autoanticorpi se leagă de epitopii conformaționali ai enzimei și îi inhibă activitatea catalitică. Antigenul este sub formă dimerică și este localizat  în citoplasmă; masa moleculară a subunităților este 50 kDa. Anticorpii anti-Jo-1 constituie un marker serologic pentru dermatomiozită/polimiozită, având o prevalență de 20-40%. Prezența acestor autoanticorpi se asociază cu o formă mai severă de boală, cu un prognostic rezervat și recăderi mai frecvente. Autoanticorpii pot fi detectați precoce, uneori precedând debutul simptomelor. La copii anticorpii anti-Jo-1 sunt extrem de rari1;3;6;7.

Recomandări pentru determinarea anticorpilor ENA BLOT  evaluarea pacienților cu  testul ANA  IIF (imunofluorescență indirectă) pozitiv și cu semne clinice sugestive de  afecțiune  reumatismală sistemică. În general nu se recomandă efectuarea ENA în prezența unui rezultat ANA IIF negativ decât dacă pacientul are semne clinice evidente de boală reumatismală și în special de sindrom Sjögren sau polimiozită (testul ANA poate fi uneori negativ în prezența unor anticorpi față de antigene foarte solubile, cum ar fi SS-A/Ro sau față de antigene citoplasmatice exprimate insuficient pe preparatele Hep-2 sau alte țesuturi, cum ar fi Jo-1)5.

Pregătire pacient – à jeun (pe nemâncate) sau postprandial (după mese)2.

Specimen recoltat – sânge venos2.

Recipient de recoltare vacutainer fără anticoagulant cu/fără gel separator2.

Prelucrare necesară după recoltare se separă serul prin centrifugare2.

Volum probă – minim 0.5 mL ser2.

Cauze de respingere a probei ser intens hemolizat, lipemic sau puternic contaminat bacterian2.

Stabilitate probă serul separat este stabil 14 zile la 4°C; timp mai îndelungat la -20 °C2.

Metodăimunoblot. Testul utilizează 7 antigene native si recombinate purificate, care sunt fixate  in cip-uri paralele pe membrana unui strip. Antigenele sunt reprezentate, în ordinea fixării pe strip, de:

– nRNP/Sm: antigen nativ purificat
– Sm: antigen nativ purificat
– SS-A: antigen nativ purificat
– Ro 52: antigen recombinat
– SS-B: : antigen nativ purificat
– Scl-70: antigen nativ purificat
Jo-1: antigen nativ purificat

Într-o primă etapă strip-ul încărcat cu antigenele purificate este incubat împreună cu serul diluat al pacientului. Dacă în ser sunt prezenți anticorpi specifici aceștia se vor lega de antigenele corespunzătoare de pe strip. După o etapă de spălare, strip-ul este incubat cu un conjugat anti-IgG uman marcat cu fosfataza alcalină. Conjugatul se va atașa la porțiunea IgG a complexului antigen-anticorp. După îndepărtarea prin spălare a conjugatului nelegat se adaugă soluția de colorare (substratul enzimei) – un sistem de detecție enzimatică colorimetrică . Dacă este prezent conjugatul legat reacția enzimatică va genera un produs colorat albastru-închis la nivelul benzilor ocupate de anticorpi specifici. Astfel, benzile vizualizate la nivelul stripului sunt rezultatul legării  anticorpilor specifici de antigenele individuale de la nivelul strip-ului.

Pe fiecare strip  există o bandă de control intern. Apariția unei reacții de culoare intense la acest nivel certifică faptul că toate etapele testului imunoblot au fost executate corect.

Valori de referință  și interpretarea rezultatelor

Interpretarea definitivă a rezultatelor testului se face cu ajutorul unui software (după scanarea strip-urilor) care în funcție de intensitatea semnalului, acordă un punctaj pentru fiecare bandă a strip-ului, astfel:

 

EVALUARE SEMNAL

INTENSITATE  SEMNAL

REZULTAT

  Fără  bandă                   0-5                0             NEGATIV
 Bandă slabă                  6-10                 (+)       ECHIVOC
Bandă medie-intensă    11-25 sau 26-50            +,++       POZITIV
Bandă foarte intensă               >50            +++      INTENS POZITIV
În final este calculată suma  punctelor acordate și se va genera rezultatul testului.
Un rezultat pozitiv confirmă prezența anticorpilor specifici .
Un rezultat echivoc indică faptul că prezența auto- anticorpilor  este incertă; în funcție de contextul clinic al pacientului testul va fi repetat la un interval de 1-2 luni.
Un rezultat negativ indică absența auto-anticorpilor specifici2.

Valori de referință2

– nRNP/Sm: negativ
– Sm: negativ
– SS-A: negativ
– Ro 52: negativ
– SS-B: negativ
– Scl-70:negativ
– Jo-1:negativ

 

Bibliografie

1.    Carlos Alberto von Mühlen, Robert M. Nakamura. Clinical and laboratory Evaluation of Systemic Rheumatic Diseases. In Henry´s Clinical Diagnosis and Management By  Laboratory Methods, Ed.Saunders, 2007, 924-928.
2.    Laborator Synevo. Referințele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2012. Ref Type: Catalog.
3.    Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Antinuclear Antibodies. www.labcorp.com  2012. Ref Type: Internet Communication.
4.    Soto ME, et al. Gender impact in systemic lupus erythematosus. In Clin Exp Rheumatol 22 (2004), 713-721.
5.    Tozzoli et al. Guidelines for the Laboratory Use of Autoantibody Tests in the Diagnosis and Monitoring of Autoimmune Rheumatic Diiseases. In Am Clin J Pathol 2002, 117, 316-324.
6.    van Venrooji WJ et al. The consensus workshop for the detection of autoantibodies to intracellular antigens in rheumatic diseases. In J Immunol Methods 5 (1991), 181-189.
7.   Yashwant Kumar et al. Antinuclear antibodies and their detection methods in diagnosis of connective tissue diseases: a journey revisited. In Diagnostic Pathology, 2009, 4:1.
< inapoi la lista

Pret 850.00 MDL