- Гематологические исследования
- Биохимические исследования
- Биохимическое исследование крови и мочи
- Специфические белки в сыворотке крови и моче
- Биохимические исследования пункционной жидкости
- Биохимические исследования кала
- Биохимические исследования наследственных нарушений обмена веществ
- Исследования при мочекаменной болезни
- Витамины, микроэлементы, оксидативный стресс
- Жирные кислоты
- Фракция трансферрина при алкоголизме
- Неинвазивные маркеры заболеваний печени
- Химический анализ камней
- Эндокринологические маркеры
- Гормоны, участвующие в углеводном обмене
- Гормоны, участвующие в процессе роста
- Гормоны, секретируемые адипоцитами
- Маркеры фертильности
- Маркеры нормальной / патологической беременности
- Гормоны надпочечников
- Гормоны щитовидной железы
- Нейрогормоны
- Пренатальный скрининг на аномалии плода
- Ренин-ангиотензин-альдостероновая система
- Онкологические маркеры
- Маркеры вирусных инфекций
- Маркеры сердечно-сосудистых патологий
- Исследование анемий
- Маркеры патологии костной системы
- Маркеры аутоиммунных болезней
- Антиспермальные антитела
- Аутоантитела при эндокринных, сердечных, почечных заболеваниях
- Аутоантитела при неврологических заболеваниях
- Аутоантитела при дерматологических заболеваниях
- Аутоантитела при пернициозной анемии
- Аутоантитела при сахарном диабете
- Маркеры аутоиммунных заболеваний печени и желудочно-кишечного тракта
- Маркеры ревматических заболеваний и васкулитов
- Маркеры для наблюдения за развитием и лечением болезней
- Маркеры антифосфолипидного синдрома
- Серологические исследования инфекционных болезней
- Аллергологические и иммунологические исследования
- Молекулярно-биологические исследования
- Цитогенетические исследования
- Микробиологические исследования
- Токсикология
- Цервико-вагинальная цитология
- Гистопатологические исследования
- Uncategorized
Бета-талассемии - генетическое тестирование (HBB)
Бета-талассемии представляют собой группу заболеваний с аутосомно-рецессивной генетической передачей, характеризующихся низкой скоростью синтеза β-цепей глобина. Генный кластер β расположен на хромосоме 11, имеет длину 50 т.п.н. и содержит в следующем порядке: ген эпсилона (ε), 2 гамма-гена (называемых Gγ и Aγ), β-псевдоген (ψβ), дельта-ген (δ) и β-ген (называемый HBB), который кодирует β-глобин Каждый ген имеет 3 последовательности, которые кодируют белки (экзоны) и 2 области, которые, по-видимому, не играют роли в синтезе белка (интроны = промежуточные последовательности), между 5 'и 3' последовательностями, которые также не вмешиваются в процесс трансляции.На 5'-конце каждого гена находится промотор, последовательность, необходимая для инициации транскрипции.Промотор β-гена включает 3 последовательности: бокс TATA, бокс CCATT и повторяющиеся мотивы CACC. И экзоны, и интроны страдают от феномена транскрипции ДНК в мессенджер РНК; этот процесс контролируется факторами транскрипции, которые связываются с промоторами и вышестоящими элементами управления - энхансерами - которые значительно увеличивают скорость транскрипции. Таким образом, гены β-глобина находятся под влиянием главного усиливающего элемента, называемого областью контроля β-локуса (β-CSF) (см. Рисунок) 1; 3
.Феномен транскрипции включает в себя следующие этапы:
- сама транскрипция: в результате получается РНК-копия гена, которая включает комплементарные последовательности как для экзонов, так и для интронов;
- инкапсуляция и полиаденилирование (кэппинг + полиаденилирование): присоединение специальных нуклеотидов к 5 'и 3' концам РНК;
- сплайсинг: удаление интронов из мРНК; последовательности РНК, соответствующие экзонам, затем «врожденные» вместе3.
Бета-талассемия чаще встречается у населения Средиземноморского бассейна, но могут быть затронуты и другие этнические группы. Серьезность дефекта является переменной. У нормальных людей есть 2 аллеля β-глобина, поэтому β-талассемия может возникать в гетерозиготном или гомозиготном состоянии. Поскольку существует большое количество мутаций, связанных с β-талассемией, возможны также случаи сложной гетерозиготности, которые возникают, когда у человека имеется 2 мутантных гена.
Описаны две широкие категории β-талассемии:
- талассемия (бета-нулевая талассемия): характеризуется отсутствием экспрессии аномального β-гена или, реже, его делецией; когда дефект появляется в гомозиготном состоянии (β / βo), синтез β-цепей и неявно гемоглобина A полностью нарушается;
–Β + талассемия (бета плюс талассемия): характеризуется пониженной (но не отсутствующей) экспрессией аномального β гена; когда дефект появляется в гомозиготном состоянии, происходит определенная продукция гемоглобина А1; 5.Сложные гетерозиготы для β-талассемии могут иметь 2 разных βo или β + гена или оба β + и β0 (β + / βo) гена.
Клиническая картина крайне изменчива. Гетерозиготный статус для β-талассемии, также называемый β-талассемией или незначительной β-талассемией, в большинстве случаев является клинически бессимптомным состоянием. Гомозиготный статус или сложная гетерозиготность по β-талассемии обычно приводит к тяжелому клиническому фенотипу, называемому основной β-талассемией, при котором пораженные люди зависят от переливания крови. Термин промежуточная β-талассемия включает клинические состояния средней степени тяжести между малой и основной формами; больные люди имеют симптомы и могут иногда требовать переливания крови, но это не является необходимым для поддержания жизни1
.Генетическое тестирование
В настоящее время известно более 200 мутаций, связанных с β-талассемией, которые можно обнаружить различными методами ПЦР, гибридизацией с синтетическими олигонуклеотидами или секвенированием.
В большинстве случаев это мутации в или около гена HBB (одиночные нуклеотидные замены, делеции или вставки олигонуклеотидов). В зависимости от генетического события описаны три типа мутаций:
- который влияет на транскрипцию β-глобина;
- что влияет на процессинг мРНК (явления сплайсинга или полиаденилирования);
- которые производят аномальный трансляция мРНК (нонсенс-мутации или мутации в рамке считывания) 3.
Небольшой процент случаев является результатом большой делеции гена или контрольных последовательностей, расположенных выше 1; 2.
С точки зрения серьезности индуцированного дефекта, мутации гена HBB делятся на две широкие категории:
Мутации, которые блокируют синтез β-глобина и вызывают β-талассемию
Нонсенс мутации: замены одного нуклеотида в нормальные кодоны, которые создают терминальный кодон; например, мутация кодона 39 (C-T) вводит концевой кодон AUG в ген, соответственно приводя к нефункциональной мРНК; эта мутация была обнаружена в подавляющем большинстве талассемических хромосом у пациентов в средиземноморском регионе.
Мутация инициирующего кодона: полностью предотвращает транскрипцию; Описано 7 мутаций кодона инициации ATG, кодирующего метионин.
Мутации в рамке считывания гена: делеции или вставки из 1, 2 или более 3 нуклеотидов, которые изменяют рамку считывания мРНК путем введения терминального кодона; например -1 в кодоне 41 (UGA); -1 в кодоне 6.
Мутации в соединении сплайсинга: все соединения интрон - экзон подтверждают правило Шамбона (5 'GT / AG 3'), необходимое для нормального сплайсинга; мутации, которые изменяют эти нуклеотиды, не будут иметь нормального сплайсинга, например IVSI-1 (G-A); IVSII-1 (G-A) 6.
Мутации, которые снижают синтез β-глобина и вызывают β + -талассемию
Мутации консенсусной последовательности: создание альтернативных сайтов сплайсинга, например: IVSI-5 (G - T); ИВСИ-6 (Т-С); последняя мутация имеет средиземноморское происхождение.
Точечные мутации в экзонах: мутации в кодирующих последовательностях могут вызывать аномальный процессинг мРНК; последовательность вокруг динуклеотида GT в кодоне 25 имеет 6 из 9 общих положений с консенсусной последовательностью в месте соединения на 5'-конце, но, по-видимому, не участвует в нормальной обработке; три мутации были описаны в этом сайте сплайсинга, которые приводят к его активации: первая мутация (G®A в кодоне 26) приводит к его собственной структуре HbE, которая связана с фенотипом легкой β-талассемии; аналогично, Hb Knossos имеет мутацию в кодоне 27 (G®T) и имеет β-талассемический фенотип; третья мутация, которая является частью этого типа, представляет собой замену A®T в кодоне 24 - молчащая замена белка, но связанная с умеренной степенью тяжести β + -талаземического фенотипа.
Точечные мутации в интронах: производят сайты сплайсинга и тем самым генерируют аберрантную мРНК в дополнение к нормальной мРНК; например IVSI-110, IVSII-745.
Промоторные мутации: в промоторной области были описаны различные мутации, которые снижают скорость связывания РНК-полимеразы, что приводит к снижению транскрипции на 20-30%; мутации 28 A → G и 29 A → G распространены в населении Китая и Африки, тогда как мутации - 87 C → G и молчащие - 101 C → T чаще встречаются в популяции средиземноморского бассейна1; 6.
Рекомендации по мутационному анализу
- установление прогноза относительно клинического фенотипа (молекулярная дифференциация промежуточной талассемии основной формы);
обнаружение носителей в семьях высокого риска;
-Пренатальная диагностика бета-талассемии.
Собранный образец - венозная кровь.
Контейнер для сбора образца- вакуумный контейнер, содержащий ЭДТА в качестве антикоагулянта.
Собранное количество - столько, сколько позволяет вакуум
Причины отторжения образца - использование гепарина в качестве антикоагулянта; коагулированные или гемолизированные образцы4.
Стабильность образца - 7 дней при 2-8ºC4.
Метод - полный секвенсор HBB4.
Интерпретация результатов
Бета-талассемия страна (гетерозиготный статус)
Люди с β-талассемией обычно протекают бессимптомно; однако возможно, что в условиях гематопоэтического стресса (беременность, интеркуррентные инфекции) появляются проявления, связанные с анемией. У некоторых пациентов может быть спленомегалия.
Гемограмма демонстрирует характерные изменения ряда эритроцитов: незначительное снижение значения гемоглобина, увеличение количества эритроцитов, низкие значения показателей эритроцитов VEM и HEM, ширина распределения эритроцитов обычно нормальная. В среднем гематологические переменные различаются в странах β0 и β +, хотя могут иметь место значительные совпадения. В случаях, когда α-талассемия сосуществует, гематологические нарушения менее выражены.
На мазке периферической крови наряду с микроцитозом могут наблюдаться гипохромия, пойкилоцитоз, «целевые» эритроциты, базофильные проколы. Исследование костного мозга показывает повышенную клеточность вследствие гиперплазии эритроида.
Диагноз основан на обнаружении повышенного процента HbA2 с помощью электрофореза гемоглобина или хроматографическим методом (ВЭЖХ). От трети до половины пациентов ассоциируется с повышенным процентом HbF.
Доля гемоглобина А2 коррелирует с типом мутации бета-талассемии. Таким образом, в большинстве случаев гетерозиготности по β0 или тяжелой β + -талассемии регистрируется процент 4-5% HbA2, в то время как при легких формах β + -талассемии этот процент обычно составляет 3,6-4,2%. Более высокий процент обнаружен в странах, связанных с делецией 5'-части гена HBB, а также в случаях мутаций в промоторе или кодоне инициации.
Причины β-талассемии с нормальным HbA2
Существуют также формы β-талассемии с нормальным процентным содержанием HbA2, называемые «тихой» β-талассемией. Например, в случае мутации C → G из положения 6, 3 'в терминальном кодоне, средний процент составляет 2,4%.
Если у человека имеются индексы эритроцитов, свидетельствующие о бета-талассемии, но уровень HbA2 не повышен, важно исключить δβ-талассемию, лепорную гемоглобинопатию и α-талассемию. Может быть γδβ-талассемия, но это состояние очень редкое. У некоторых пациентов с железодефицитной анемией могут быть атипичные показатели эритроцитов; особенно у детей может быть железодефицитная анемия, сопровождающаяся повышенным количеством эритроцитов.
Низкий уровень ферритина указывает на дефицит железа, но не исключает диагноз бета-талассемии.
Мутации HBB, связанные с незначительными или отсутствующими гематологическими нарушениями в гетерозиготном статусе, представляют важные диагностические проблемы; их идентификация необходима, потому что они могут вызывать клинически значимое состояние гомозиготных или гетерозиготных соединений. Эти типы мутаций можно разделить на две группы:
- мутации, которые вызывают «тихую талассемию» с индексами эритроцитов и нормальным процентным содержанием HbA2;
-мутации, которые вызывают «почти бесшумную талассемию» с нормальным HbA2 и измененными индексами эритроцитов.
Эти формы могут быть обнаружены только путем генетического тестирования. Некоторые мутации, такие как +1480 C → G в греческом населении, настолько слабы, что почти всегда вызывают «тихую талассемию». Мутации, наиболее часто ответственные за эту форму талассемии: -101 C → T и -92 C → T, связанные со следующими средними значениями: VEM = 83,9 мкл, HEM = 28,6 пг и HbA2 = 3,4%. «Почти бесшумная талассемия» возникает в результате небольшой группы мутаций, таких как CAP + 1 A → C в Индии и иногда IVS-6 T → C в Средиземноморье. Гетерозиготы для IVS-6 T → C показывают следующие диапазоны значений: VEM = 60-78 мкл и HbA2 = 3,2-4-6%.
Дефицит железа снижает процентное содержание HbA2 как у людей без дефектов глобина, так и у людей с бета-талассемией. Это не проблема для людей с генетической аномалией, сопровождающейся значительным увеличением HbA2, но для людей с легкими мутациями, связанными с незначительным увеличением дефицита железа в HbA2, маскирует страну бета-талассемии. По этой причине рекомендуется, чтобы у пациентов с тяжелой или умеренной железодефицитной анемией дефицит железа сначала корректировался, после чего, если изменения в показателях эритроцитов сохраняются, следует измерять процентное содержание HbA2. Исключение из этой рекомендации будет сделано у беременных пациентов, у которых диагноз бета-талассемии должен быть поставлен немедленно. В этой ситуации необходимо исследовать партнера; если это выявлено в стране бета-талассемии, генетическое тестирование будет проводиться у беременных женщин с пограничным уровнем HbA2.
Мегалобластная анемия также может привести к снижению уровня HbA2 и помешать диагностике β-талассемии.
Ассоциация измененных индексов эритроцитов с нормальным уровнем HbA2 также может быть результатом сосуществования δ-талассемии с мутацией β0 или β +, которая индуцирует высокий процент HbA2 (обнаруживается у ящериц и кипарисов). Кносский гемоглобин также ответственен за некоторые случаи β-талассемии с нормальным уровнем HbA2.
Наличие сопутствующего присутствия легкой мутации β-талассемии (такой как CAP + 1 A → C) и штамма α0-талассемии или гомозиготного статуса по α + -талассемии приводит к тому, что диагноз силы β-талассемии часто опускается.
Β-талассемия в стране с нормальными показателями эритроцитов и повышенным уровнем HbA2
У некоторых гетерозиготных пациентов при определенных вариантах легкой β-талассемии могут иметь место повышенные уровни HbA2 при наличии нормальных показателей эритроцитов; это состояние было обнаружено у некоторых пациентов с мутацией -101 C → T.
Кроме того, сосуществование α и β-талассемии может привести к нормальным показателям эритроцитов за счет более сбалансированного синтеза цепей глобина, но с повышенным процентом HbA2. Это изменение особенно заметно у пациентов с делециями двух α-генов или формой не-делеционной α-талассемии.
Приобретенные аномалии, например вызванные заболеванием печени, могут увеличивать значения индексов эритроцитов у пациентов с β-талассемией.
Все эти примеры иллюстрируют сложность случаев заболевания бета-талассемией в стране и сложность их выявления, причем генетическое тестирование иногда является единственным исследованием, которое может подтвердить диагноз1; 2.
Бета-талассемия доминантная
Хотя большинство людей, гетерозиготных по мутации β-талассемии, имеют клинико-патологические признаки, описанные как незначительная талассемия (измененная гематологическая картина при отсутствии клинических проявлений), у некоторых из них развивается спленомегалия, анемия, желтуха и камни в желчном пузыре, состояние, называемое β-талассемией. Фенотип сходен с промежуточным β-талассемией и связан как с неэффективным эритропоэзом, так и с гемолитическим компонентом. Характерно наличие эритробластов с включениями (состоящими из избыточных α-цепей и β-аномальных цепей).
Описано более 30 аллелей, которые индуцируют доминантный фенотип β-талассемии, включая мутации в 3'-области экзонов 2 или 3, которые вызывают значительное количество мутантной мРНК. Как следствие, синтезируются усеченные или удлиненные β-цепи, крайне нестабильные, которые осаждаются вместе с нормальными α-цепями1.
Промежуточная бета-талассемия
Это относится к клиническому фенотипу, вызванному различными генетическими отклонениями. Тяжесть промежуточной β-талассемии варьируется от клинического состояния, сопровождающегося задержкой роста и деформациями костей, при котором выживание редко возможно без переливания крови, до более легких форм, похожих на β-талассемию, но связанных с более высокой степенью. анемии и спленомегалии.
Могут возникнуть такие осложнения, как: гиперспленизм, камни в желчном пузыре, перегрузка железом, компрессия, вызванная массами экстрамедуллярной кроветворной ткани на жизненно важных органах.
Гематологическая картина включает аномалии, сходные с теми, которые вызваны типичной гетерозиготной β-талассемией, но имеет более высокую степень тяжести; наряду с микроцитозом могут возникнуть гипохромия, анизоцитоз, пойкилоцитоз, базофильные проколы, полихроматофилия и циркулирующие эритробласты.
Электрофорез гемоглобина или ВЭЖХ указывает на повышенные уровни HbA2 (выше, чем в стране с β-талассемией) и HbF.
Промежуточная бета-талассемия
Это относится к клиническому фенотипу, вызванному различными генетическими отклонениями. Тяжесть промежуточной β-талассемии варьируется от клинического состояния, сопровождающегося задержкой роста и деформациями костей, при котором выживание редко возможно без переливания крови, до более легких форм, похожих на β-талассемию, но связанных с более высокой степенью. анемии и спленомегалии.
Могут возникнуть такие осложнения, как: гиперспленизм, камни в желчном пузыре, перегрузка железом, компрессия, вызванная массами экстрамедуллярной кроветворной ткани на жизненно важных органах.
Гематологическая картина включает аномалии, сходные с теми, которые вызваны типичной гетерозиготной β-талассемией, но имеет более высокую степень тяжести; наряду с микроцитозом могут возникнуть гипохромия, анизоцитоз, пойкилоцитоз, базофильные проколы, полихроматофилия и циркулирующие эритробласты.
Электрофорез гемоглобина или ВЭЖХ указывает на повышенные уровни HbA2 (выше, чем в стране с β-талассемией) и HbF.
Генетические тесты облегчают выявление аномалий, которые определяют фенотип промежуточной β-талассемии1; 5.
Бета-талассемия
Сложные гомозиготные или гетерозиготные пациенты с мутациями β-талассемии, которые зависят от переливания крови, имеют клиническое состояние, называемое большой β-талассемией.
Заболевание часто распознается на первом году жизни, начиная с возраста 3 месяцев; он характеризуется тяжелой анемией, сопровождающейся ускоренным эритропоэзом, как в медуллярном, так и в экстрамедуллярном секторах. Гемопоэтическое расширение приводит к серьезным деформациям костей, особенно костей черепа и лица; экстрамедуллярный гемопоэз приводит к массивной гепатоспленомегалии.
Ряд эритроцитов имеет следующие значения: Hb = 3-7 г / дл, VEM = 50-60 дл, HEM = 12-18 пг. Мазок крови включает выраженный микроцитоз, гипохромию, выраженный анизоцитоз и пойкилоцитоз, базофильные проколы, циркулирующие эритробласты с гемоглобинизация и дизеритропоэтические особенности.
В случаях гомозиготности или гетерозиготности соединений по β0-талассемии (β0 / β0) электрофорез в гемоглобине или метод ВЭЖХ указывают на присутствие только HbA2 и HbF; когда пациенты имеют гомозиготность по β + -талассемии (β + / β +) или сложную гетерозиготность по β0 и β + -талассемии (β + / β0), HbA также присутствует в количестве до 35%.
При β-талассемии процент HbA2 может быть нормальным, высоким или, иногда, низким1; 2.
Список используемой литературы
- Барбара Дж. Бейн. Диагностика гемоглобинопатии. Blackwell Science, 2001, 7-9; 73-93.
- Катерина Боргна Пинатти, Ренцо Галанелло. Талассемия и связанные с ней нарушения синтеза гемоглобина. В Wintrobe`s Clinical Hematology, 11th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 1083-1118.
- Кизил Миронель Niculae. Транскрипция (транскрипция). Биоинформатика. fpce9.fizica.unibuc.ro/bioinfo/transcrierea.htm. Тип ссылки: Интернет-связь.
- Синевская лаборатория. Конкретные ссылки на рабочую технологию, использованную в 2010 году. Тип ссылки: Каталог.
- Ренцо Галанелло, Антонио Цао. Бета-талассемия. Джин Обзоры, 2007. www.ncbi.nlm.nih.gov. ReferenceType: Интернет-общение.
- Талмач Р. Молекулярная диагностика -талассемии. Достижения в области биотехнологии, том II. Ed. Ars Docendi, p.179-188, 2002.