int(0)

Teste de laborator

Pachete de analize medicale

Planșa anatomică

Teste de la A la Z A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z
Teste Laborator
Product categories
Pachete analize Plansa anatomica
< inapoi la lista

Chlamydia trachomatis ARNr + N. gonorrhoeae ARNr – urină

Pret 480.00 MDL

Инфекции Chlamydia trachomatis (CT) и Neisseria gonorrheae (GC) являются двумя наиболее распространенными венерическими заболеваниями в мире. Учитывая только Соединенные Штаты, Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC) сообщили в 2010 году 1 307 893 новых случаев инфекции Chlamydia trachomatis и 309 341 новых случаев инфекции Neisseria gonorrhoeae1.
Хламидия – это очень маленькая грамотрицательная бактерия, обязательно внутриклеточная из-за того, что она не может синтезировать свою АТФ, будучи культивируемой только в живых эукариотических клетках (яйца с эмбрионами или клеточные культуры).
Последние классификации делят хламидиоз на 4 семейства, из которых наиболее важной в патологии человека является семейство Chlamydiaceae, которое содержит два рода:
• род Chlamydia – наиболее важным представителем является C. trachomatis;
• род Chlamydophila – C. pneumoniae, C. psittaci, C. pecorum, C. abortus и др.
Chlamydia trachomatis встречается почти исключительно у людей. Описано 15 сероваров, вовлеченных в различные инфекции, причем серовары D и K являются основными причинами хламидийной инфекции у женщин и мужчин2;
Для инфекции Chlamydia trachomatis наиболее пораженной возрастной группой является 15-25 лет, распространенность инфекции составляет от 2 до 25%.
Инкубационный период заболевания обычно варьируется от 1 до 3 недель, достигая в некоторых случаях 6 недель. Большая доля инфекций развивается бессимптомно: 75% инфекций у женщин и 50% инфекций у мужчин. В симптоматических случаях уретрит и проктит могут встречаться у мужчин в острой фазе; При отсутствии лечения может возникнуть хронический эпидидимит, простатит и реактивный артрит. Клинические проявления у женщин состоят из уретрита, цервицита и бартолинита, которые могут осложняться: эндометритом, сальпингитом, пельвиперитонитом, перигепатитом и реактивным артритом.
Бессимптомная природа многих инфекций Chlamydia trachomatis ответственна за их недиагностику с важными последствиями, особенно у женщин, из-за доказанной корреляции между нелеченной инфекцией и осложнениями, такими как внематочная беременность и бесплодие.
Будучи венерическим заболеванием, оценка партнеров обязательна для предотвращения повторных инфекций.
Как и в случае других венерических заболеваний, инфекция Chlamydia trachomatis может способствовать передаче ВИЧ-инфекции. Кроме того, новорожденные могут заразиться при прохождении через цервикальный канал и развить конъюнктивит, фарингит и пневмонию4;
Лабораторная диагностика инфекций Chlamydia trachomatis включает в себя выделение возбудителя в клеточных культурах, обнаружение антигена методами прямой иммунофлуоресценции (DFA) или иммуноферментными методами, а также определение бактериального генетического материала с помощью молекулярных методов. Поскольку клеточные культуры трудоемки и требуют много времени, они не используются регулярно, что является прерогативой специальных лабораторий. Более того, согласно литературным данным, разработка технологий амплификации нуклеиновых кислот (NAAT) значительно улучшила клиническую чувствительность обнаружения КТ, так что выделение этого патогена в клеточных культурах больше не считается методом «золотого стандарта».
В настоящее время в США большинство программ скрининга и лабораторных испытаний основаны на этой технологии4;
Neisseria gonorrhoeae, грамотрицательный диплококк, является этиологическим агентом гонореи, одного из наиболее распространенных венерических заболеваний.
У мужчин инфекция в большинстве случаев симптоматическая и связана с передним уретритом, сопровождающимся гнойной секрецией. Инкубационный период составляет 1-10 дней. У женщин основным местом заражения является эндоцервикс. Это описывает увеличенную распространенность сопутствующих инфекций с Chlamydia trachomatis и Trichomonas vaginalis, а также связь с бактериальным вагинозом. Многие женщины остаются бессимптомными и поэтому не обращаются к врачу. Когда появляются клинические проявления, они представлены измененными выделениями из влагалища, дизурией, диспареунией, межменструальным кровотечением. Другими возможными локализациями гонококковой инфекции являются прямая кишка, глотка, конъюнктива; Распространенные инфекции могут возникать редко. Дети, рожденные от инфицированных матерей, могут иметь конъюнктивит.
При отсутствии адекватного лечения антибиотиками могут развиться острые или поздние осложнения, такие как: эпидидимит или простатит у мужчин; воспалительные заболевания органов малого таза, перигепатит, бесплодие, внематочная беременность у женщин4;
N. gonorrhoeae – это лабильный микроб, который не выживает в образцах, которые собираются вне лаборатории. По этой причине микробиологическая диагностика на основе культуры в этих случаях имеет низкое значение. Как и в случае с КТ-инфекциями, разработка технологий NAAT позволила улучшить обнаружение гонококковых инфекций, и эти методы, очевидно, имеют ряд преимуществ по сравнению с классическими методами культивирования:
• поскольку бактериальная ДНК обнаружена, микроорганизму не обязательно быть жизнеспособным;
• имеет более высокую чувствительность;
• у мужчин тест может быть выполнен с мочой, что повышает соблюдение пациентом режима исследования7.
В качестве заключения к вышеупомянутым Chlamydia trachomatis (CT) и Neisseria gonorrhoeae (GC) являются патогенами, наиболее часто вовлеченными в венерические заболевания, вызываемые бактериями. Важно отметить, что ко-инфекция CT-GC регистрируется примерно в 30% случаев (чаще у женщин), следовательно, необходимо комбинированное тестирование двух патогенов.
Ранняя диагностика инфекций является сложной задачей, потому что у значительной части пораженных людей нет никаких симптомов. При отсутствии диагноза и лечения они могут привести к диссеминированным инфекциям у мужчин и воспалительным заболеваниям таза у женщин со значительными поздними последствиями: бесплодие, внематочная беременность, хроническая тазовая боль5; 8. При обеих инфекциях возможна перинатальная передача при развитии конъюнктивита у новорожденного. КТ и ГК также связаны с повышенным риском передачи ВИЧ. Одним из лучших способов предотвращения осложнений КТ и ГК-инфекций является обследование подростков и молодых людей, а также беременных женщин. Если у человека диагностирована одна или обе инфекции, все сексуальные партнеры должны пройти тестирование и пройти соответствующее лечение.
Руководства CDC (Центры по контролю и профилактике заболеваний) рекомендуют проводить скрининг с помощью тестов амплификации нуклеиновых кислот с высокой чувствительностью и специфичностью, подтверждая, что молекулярные методы в настоящее время являются диагностическим стандартом для инфекций CT и GC4.
Доступные в настоящее время методы, основанные на технологии NAAT, включают полимеразную цепную реакцию (ПЦР), CSF (лигазная цепная реакция), CSA (амплификация смещения цепей) и TMA (транскрипционно-опосредованная амплификация) 8. Растущее использование технологии NAAT для обнаружения КТ и НГ показало, что, как уже упоминалось выше, многие половые инфекции протекают бессимптомно9.
В нашей лаборатории мы используем автоматизированный метод ТМА, который, в отличие от других упомянутых методов, основанных на амплификации бактериальной ДНК, усиливает рибосомную РНК (рРНК). Тест APTIMA COMBO 2 позволяет одновременно качественно определять КТ и ГХ, а также предлагает новый молекулярный подход, комбинируя технологии «захват цели», TMA («Транскрипционно-опосредованное усиление») и DKA («Двойной кинетический анализ»). Основным преимуществом этого метода по сравнению с другими методами NAAT является то, что он нацелен на молекулы рРНК, которые присутствуют в клетках в большем количестве по сравнению с молекулами ДНК, что приводит к повышению чувствительности, что снижает риск ложноотрицательные результаты.
Принцип метода:
Тест включает в себя 3 этапа:
-Захватить цель
– усиление
-обнаружение
Образцы собираются и переносятся в соответствующие транспортные пробирки. Растворы в этих пробирках высвобождают молекулы рРНК и защищают их от деградации во время хранения.
Захват рРНК – молекулы-мишени – осуществляется с помощью захвата олигонуклеотидов, которые связываются с другими нуклеотидами, присутствующими на поверхности магнитных микрочастиц. Захватывающие олигомеры используют последовательности, комплементарные определенным участкам молекулы-мишени, которые присоединяются к ним во время стадии гибридизации. Образованные таким образом комплексы магнитно разделяют и несколько раз промывают для удаления веществ, которые могут мешать или ингибировать последующую реакцию амплификации, таким образом снижая риск ложноотрицательных результатов.
Реакция амплификации основана на способности комплементарных праймеров (олигонуклеотидов) специфически связываться и облегчать ферментативную амплификацию. Анализ APTIMA позволяет реплицировать специфическую последовательность из 23S-области рРНК для CT и 16S для GC. Для каждой молекулы-мишени используется уникальный набор праймеров. В реакции TMA используются два фермента – РНК-полимераза и обратная транскриптаза – амплификация проводится в изотермических условиях, в отличие от методов ПЦР. На первой стадии процесса ТМА промоторный праймер гибридизуется с рибосомной РНК-мишенью. Обратная транскриптаза распознает эту последовательность промотора праймера и создает ДНК-копию РНК-мишени (кДНК, комплементарная ДНК). Последовательность РНК в гибриде ДНК: РНК будет затем удалена активностью обратной транскриптазы РНКазы H. Второй праймер связывается с молекулой кДНК, и обратная транскриптаза синтезирует новую цепь ДНК, в результате чего образуется двухцепочечная молекула ДНК.
РНК-полимераза распознает промоторную последовательность в цепи ДНК и инициирует транскрипцию (процесс образования РНК в ДНК). Весь этот процесс повторяется, образуя миллионы РНК-ампликонов всего за 60 минут.
Третий этап – обнаружение ампликонов. После амплификации в реакцию вводят ДНК-зонд, меченный эфирами акридиния. Если ампликон-мишень присутствует, зонд гибридизуется и образуется стабильный комплекс зонд-ампликон. Затем добавляется реагент для отбора, который удаляет несвязанные молекулы акридиния. Следующим этапом является гидролиз молекул эфира акридиния, связанных с ампликон-зондовыми комплексами, и получение светового сигнала. На этапе обнаружения свет, испускаемый этими гибридами, измеряется люминометром в виде фотонных сигналов и сообщается в RLU (относительные световые единицы).
Для каждой из двух мишеней рРНК будет использоваться ДНК-зонд, меченный различными эфирами акридиума. Благодаря технологии DKA различия между кинетическими профилями зондов CT и GC позволяют различать сигнал, обнаруженный хемилюминесценцией. Результаты испытаний устанавливаются с использованием отсечки на основе общего значения RLU и типа обнаруженной кинетической кривой6.
Характеристики и преимущества теста APTIMA Combo 2
Рабочие характеристики теста APTIMA Combo 2 были установлены после многоцентрового исследования, проведенного в Северной Америке, которое включало 2932 пробы мочи и генитальные пробы, собранные на тампоне у лиц с симптомами и без симптомов (1569 женщин и 1363 мужчины).
В случае образцов, собранных на эндоцервикальном буфере, сообщалось следующее:
Для КТ: чувствительность 94,2%, специфичность 97,6%
Для ГХ: чувствительность 99,2%, специфичность 99,6%
и при использовании образцов мочи у мужчин:
Для КТ: чувствительность 97,9%, специфичность 98,5%
Для ГХ: чувствительность 98,5%, специфичность 99,6 %6.
Метод TMA обладает самой высокой чувствительностью из всех методов, основанных на технологии NAAT, и способен обнаруживать очень небольшое количество нуклеиновых кислот в образце. Чувствительность теста APTIMA Combo 2, проведенного на большом количестве образцов (1304 пробы мочи и генитальных проб, собранных на тампоне), оказалась явно выше чувствительности определения культуры клеток или метода DFA9. Это также единственная методика, в которой было показано, что чувствительность теста мочи эквивалентна чувствительности теста, проведенного на пробе мазка10.
Метод идентификации CT / GC, запатентованный компанией GenProbe (США), позволяет на первом этапе захватывать рибосомные молекулы РНК с помощью магнитных шариков, затем их усиление и обнаружение полученного сигнала, используя технику DKA, которая включает другая кинетика испускания и захвата света соответственно. Весь процесс, который происходит после ввода первичной трубки в анализатор, выполняется полностью автоматически, что позволяет избежать возможного загрязнения или ошибок, вносимых пользователем. Из-за этапов промывки, включенных в начале аналитического процесса, возможность получения ложноотрицательных результатов из-за ингибиторов или мешающих факторов (хорионический гонадотропин человека, кристаллы, нитриты, гемоглобин) практически исключена. Кроме того, этот метод устраняет перекрестную реактивность с другими микроорганизмами, которые могут присутствовать в мочеполовом тракте в качестве возможной потери бактериальной ДНК во время процесса экстракции, что может повлиять на реакцию амплификации и привести к ложноотрицательным результатам9.
Эффективность теста APTIMA Combo 2 была также подтверждена для обнаружения мутантных штаммов Chlamydia trachomatis, результаты подтверждают, что тест способен идентифицировать вариант шведского СТ, который имеет делецию в загадочной плазмиде, и что некоторые коммерческие тесты не обнаруживают11.
Все эти данные подтверждают точность теста APTIMA Combo 2 и рекламируют его как элитный тест в молекулярной диагностике.
В нашей лаборатории в качестве пробы у женщин используются образцы эндоцервикального тампона, а у мужчин – первая струя мочи. Как упоминалось выше, тестирование образцов мочи имеет очень хорошую чувствительность и специфичность, что представляет собой неинвазивную альтернативу анализу образцов уретры6.
Рекомендации по определению Chlamydia trachomatis – диагностика острых урогенитальных инфекций, скрининг инфекций у лиц высокого риска; скрининг беременных женщин в первом триместре беременности (для беременных женщин ≤ 25 лет и для лиц с высоким риском развития инфекций КТ и НГ тест будет повторен в третьем триместре; в случае беременных женщин, которые получили положительный результат в первом триместре беременности) будет повторяться через 3-6 месяцев) 4; 7.
Взятые образцы – образцы будут взяты из мочеполовой системы: эндоцервикальный мазок для женщин и первая реактивная моча для мужчин; для женщин будут использоваться тампоны, включенные в системы сбора, предоставляемые лабораторией (см. рисунок 1).
Коллекция эндоцервикальных проб
Перед фактическим сбором избыток слизи будет удален из отверстия шеи с помощью тампона из белой палочки, включенного в набор (APTIMA CLEANING SWAB); затем вставьте другой тампон с синим стержнем (APTIMA COLLECTION SWAB) в цервикальный канал, осторожно поверните 5 раз в одном направлении (10-30 секунд), затем слегка втяните, избегайте контакта со слизистой влагалища и будет вставлен в транспортную трубку; тампон сломается около отметки, так что только конец тампона останется в транспортной трубке, плотно прилегающей к крышке. Трубка будет надлежащим образом маркирована и отправлена ​​в лабораторию. Не прикасайтесь к крышке алюминиевой фольги трубки.
Каждый образец будет упакован отдельно в специальные оранжевые пакеты.
Сбор образцов мочи
До фактического сбора пациент не должен мочиться не менее 1 часа; затем его собирают в одноразовый контейнер с плотно прилегающей крышкой (например, 24-часовой писсуар, предоставленный лабораторией) примерно в 20-30 мл первого потока мочи.
В течение 24 часов после сбора приблизительно 2 мл образца мочи, собранного пациентом, будет перенесено в транспортную трубку на изображении ниже. До тех пор образец будет храниться при 2-30ºC.
Перенос образца в транспортную пробирку будет выполняться в лаборатории с использованием пластиковой пипетки из набора. Если образцы не могут добраться до лаборатории в течение 24 часов, сотрудники Synevo запросят транспортные пробирки, чтобы перенести образцы в соответствующие места.
Для обеспечения правильного объема мочи уровень жидкости должен находиться между двумя черными линиями, отмеченными стрелками на этикетке пробирки. Трубка будет запечатана и правильно маркирована. Для хорошей гомогенизации мочи со стабилизирующей средой в пробирке, 5 инверсионных движений пробирки будут выполнены, не касаясь крышки алюминиевой фольги пробирки.
Каждый образец будет упакован отдельно в специальные оранжевые пакеты.
Стабильность образца – 2 месяца при температуре 2-30ºC для эндоцервикальных образцов и для стабилизированных образцов мочи (переносится в пробирку) 6.
Метод – ТМА (транскрипционно-опосредованная амплификация); используются следующие типы контролей: положительный контроль CT / отрицательный контроль GC и положительный контроль GC / отрицательный контроль CT6.
Пределы обнаружения
Коннектикут
Сообщается об аналитической чувствительности 1 IFU / тест (7,25 IFU / буфер и 5 IFU / мл мочи). Тем не менее, исследования показали 100% позитивность при разведениях КТ <1 IFU / тест.
IFU = учебные блоки включения
NG:
Сообщается об аналитической чувствительности 50 клеток / тест (362 клеток / буфер и 250 клеток / мл мочи)
Тем не менее, исследования показали 100% позитивность при разведениях GC <50 клеток / тест6.
Справочные значения и отчетность о результатах
РРНК Chlamydia trachomatis (CT) не обнаруживается.
Neisseria gonorrhoeae (NG) не обнаруживаемая рРНК.
Результаты представлены как необнаружимые / положительные / двусмысленные. В случае двусмысленного результата, тест проводится повторно; если получен сомнительный результат, рекомендуется повторить сбор образцов.
Можно получить неверный результат, который указывает на ошибку в аналитическом процессе, которая необходима для повторного тестирования образца или, в некоторых случаях, для повторного сбора урожая.
Интерпретация результатов, ограничений и вмешательств
Неопределяемый результат указывает на то, что CT и / или G рРНК не присутствует в тестируемом образце; однако наличие инфекции не исключается, поскольку частота выявления зависит от сбора образца, количества рибосомальной РНК в образце, отсутствия ингибиторов или стадии инфекции.
Положительный результат указывает на то, что рРНК для КТ и / или ГХ присутствует в тестируемом образце и является сильным показателем инфекции.
Однако положительная прогностическая ценность теста зависит от распространенности инфекции в определенной популяции или группе. Таким образом, в группах с высокой распространенностью венерических заболеваний положительная прогностическая ценность возрастает. Напротив, в группах с низкой распространенностью этих категорий инфекций положительные результаты следует тщательно интерпретировать в общем клиническом контексте пациента, принимая во внимание возможность повторного тестирования другими методами (например, культура для Neisseria gonorrheae).
Присутствие слизи в эндоцервикальных образцах не влияет на обнаружение CT и GC в тесте APTIMA Combo 2, но рекомендуется удалить избыток слизи, чтобы в образце было достаточное количество CT-инфицированных эндоцервикальных клеток. Кроме того, наличие крови не влияет на эффективность теста, если только он не обнаружен в процентах, превышающих 10% (об. / Об.) В образцах эндоцервикала и более 30% (об. / Об.) В образцах мочи.
Никакого вмешательства со смазками или спермицидами не наблюдалось для эндоцервикальных тампонов. Кроме того, образцы мочи не влияли на присутствие витаминов и минералов.
Производительность, установленная для образцов мочи, основана на тестировании первого потока мочи. Для других типов образцов мочи эффективность не оценивалась.
Тест также обнаруживает не содержащие плазмиды варианты C. trachomatis.
Никаких перекрестных реакций с непатогенными видами Neisseria, присутствующими в ротоглотке, для GC обнаружено не было.
В целом, тест не рекомендуется для оценки эффективности лечения антибиотиками, поскольку нуклеиновые кислоты в этих возбудителях могут сохраняться в течение не менее 3 недель после окончания терапии. По истечении этого периода повторное тестирование полезно для беременных женщин, когда подозревается несоблюдение режима лечения или повторное заражение и в тех случаях, когда симптомы сохраняются.
Список используемой литературы
1. Центры по контролю и профилактике заболеваний. 2011. Эпиднадзор за болезнями, передаваемыми половым путем. 2010. Атланта, Джорджия: США. Департамент здравоохранения и социальных служб.
2. Бетти А. Форбс, Даниэль С. Сам, Алиса С. Вайсфельд – Обязательные внутриклеточные и некультурабильные бактериальные агенты. Диагностическая микробиология Бейли и Скотта, 12 изд., 2007, 510-524.
3. Ричард А. МакПетерсен, Мэтью Р. Пинкус. Хламидийные, риккетсиозные и микоплазменные инфекции. В Генри Клиническая диагностика и управление лабораторными методами – Sauders Elsevier 21-Ed 2007 – стр. 1002, 1003.
4. Центры по контролю и профилактике заболеваний, «Рекомендации по лечению венерических заболеваний 2010», MMWR Recomm Rep, 2010, том 59 (RR12): 1-116.
5. Бернард М. Карнатх. Проявления гонореи и хламидийных инфекций. В больнице врач май / июнь 2009 г. www.turner-white.com.
6. Сыневская лаборатория. Конкретные ссылки на используемую технологию работы 2014 года. Тип ссылки: Каталог.
7. Джонсон Р.Э., Ньюхолл В.Дж., Папп Дж.Р. и др. «Скрининговые тесты для выявления Chlamydia trachomatis и Neisseria gonorrhoeae», MMWR Recomm Rep, 2002, 51 (RR15): 1-38.
8. Специализированные лаборатории. Chlamydia trachomatis и Neisseria gonorrhoeae для пациентов с симптомами и без симптомов. www.specialtylabs.com. Тип ссылки: Интернет-связь.
9. Б. Бояджян, Т. Яшина, Дж. Х. Ятабэ, М. Патнаик, С. С. Хилл. Сравнение анализов APTIMA CT и GC с анализом APTIMA Combo 2, анализом Abbott LCx и прямым анализом флуоресцентных антител и культур для выявления Chlamydia trachomatis и Neisseria gonorrhoeae. В журнале клинической микробиологии, июль 2004 г., том 42, № 7, 3089–93.
10. Crotchfelt, К. A., B. Pare, C. Gaydos, T. C. Quinn. Обнаружение Chlamydia trachomatis с помощью Gen-Probe AMPLIFIED Chlamydia Trachomatis (AMP CT) в образцах мочи от мужчин и женщин и эндоцервикальных образцах от женщин. J. Clin. Microbiol. 1998; 36: 391-394.
11. Мёллер Дж. К., Педерсен Л. Н., Перссон К. Сравнение транскрипционно-опосредованной амплификации Gen-Probe, ПЦР Abbott и ПЦР Roche для выявления штаммов дикого типа и мутантных плазмид Chlamydia trachomatis в Швеции. J Clin Microbiol. Декабрь 2008 г .; 46 (12): 3892–3895.
12. Клиника Майо, Медицинские лаборатории Майо. Справочные лабораторные службы для организаций здравоохранения. Chlamydia trachomatis и Neisseria gonorrhoeae путем амплификации нуклеиновых кислот (GEN-PROBE). www.mayomedicallaboratories.com. 2014. Тип ссылки: Интернет-связь.

 

Informații generale

Infecțiile cu Chlamydia trachomatis (CT) și Neisseria gonorrheae (GC) sunt două din cele mai frecvente boli cu transmitere sexuală din lume. Luând în considerare doar Statele Unite ale Americii, Centers for Disease Control and Prevention (CDC) a raportat în 2010 1,307,893 cazuri noi de infecție cu Chlamydia trachomatis și 309,341 cazuri noi de infecție cu Neisseria gonorrhoeae1.

Chlamydia este o bacterie Gram negativă de dimensiuni foarte mici, obligatoriu intracelulară datorită faptului că nu își poate sintetiza ATP-ul, fiind cultivabilă doar în celulele vii eucariote (ouă embrionate sau culturi celulare).

Clasificări recente împart Chlamydiile în 4 familii, dintre care cea mai importantă în patologia umană este familia Chlamydiaceae, care conține două genuri:

• genul Chlamydia – cel mai important reprezentant fiind C. trachomatis;
• genul Chlamydophila – C. pneumoniae, C. psittaci, C. pecorum, C. abortus, etc.

Chlamydia trachomatis este întâlnită aproape în exclusivitate la om. Sunt descrise 15 serovaruri implicate în diverse infecții, serovarurile D și K fiind cauzele majore de infecție chlamidiala la femei și bărbați2;3.

Pentru infecția cu Chlamydia trachomatis, grupa de vârstă cea mai afectată este 15-25 ani, prevalența infecției fiind între 2 și 25%.

Perioada de incubație a bolii variază în general între 1 și 3 săptămâni, ajungând în unele cazuri la 6 săptămâni. O mare parte a infecțiilor evoluează asimptomatic: 75% din infecții la femei și 50% din infecții la bărbați. In cazurile simptomatice la bărbat pot apărea uretrita și proctita în fază acută; în lipsa tratamentului se poate instala cronicizarea cu epididimită, prostatită și artrita reactivă. Manifestările clinice la femeie constau în uretrită, cervicită și bartolinită care se pot complica cu: endometrită, salpingită, pelviperitonită, perihepatită precum și artrita reactivă.

Caracterul asimptomatic al multor infecții cu Chlamydia trachomatis este responsabil de subdiagnosticarea acestora, cu importante consecințe mai ales la femei datorită corelației dovedite între infecția netratată și complicații cum ar fi sarcina ectopică și infertilitatea.

Fiind o boală cu transmitere sexuală evaluarea partenerilor este obligatorie pentru a preveni reinfecțiile.

Ca și în cazul altor boli cu transmitere sexuală infecția cu Chlamydia trachomatis poate facilita transmiterea infecției HIV. În plus, nou-născuții se pot infecta la trecerea prin canalul cervical și pot dezvolta conjunctivită, faringită și pneumonie4;5;6.

Diagnosticul de laborator al infecțiilor cu Chlamydia trachomatis include izolarea agentului patogen în culturi celulare, depistarea antigenului prin imunofluorescență directă (DFA) sau metode imuno-enzimatice și determinarea materialului genetic bacterian prin tehnici moleculare. Deoarece culturile celulare sunt laborioase și necesită timp nu se folosesc de rutină fiind apanajul unor laboratoare speciale. Mai mult, conform datelor din literatura de specialitate, dezvoltarea tehnologiilor de amplificare a acizilor nucleici (NAAT) a îmbunătățit semnificativ sensibilitatea clinică a detecției CT, astfel că izolarea acestui patogen în culturi celulare nu mai este considerată metoda „gold standard”.

La ora actuală în SUA cele mai multe programe de screening și teste de laborator sunt bazate pe această tehnologie4;6.

Neisseria gonorrhoeae, un diplococ Gram negativ, este agentul etiologic al gonoreei, una din cele mai frecvente boli cu transmitere sexuală.

La bărbați infecția este în cele mai multe cazuri simptomatică, fiind asociată cu uretrita anterioară însoțită de secreție purulentă. Perioada de incubație este de 1-10 zile. La femei principala localizare a infecției este endocervixul. Se descrie o prevalență crescută a coinfecțiilor cu Chlamydia trachomatis și Trichomonas vaginalis precum și asocierea cu vaginoza bacteriană. Multe dintre femei rămân asimptomatice și din acest motiv nu se prezintă la medic. Atunci când apar manifestările clinice acestea sunt reprezentate de secreții vaginale modificate, disurie, dispareunie, sângerări intermenstruale. Alte posibile localizări ale infecției gonococice sunt rectul, faringele, conjunctiva; rareori se pot produce infecții diseminate. Copiii născuți din mame infectate pot prezenta conjunctivită.

În absența tratamentului antibiotic adecvat se pot dezvolta complicații acute sau tardive, cum ar fi: epididimita sau prostatita la bărbați; boala inflamatorie pelvină, perihepatita, infertilitate, sarcini ectopice la femei4;5;6.

N. gonorrhoeae este un germene labil care nu supraviețuiește în probele ce sunt recoltate în afara laboratorului. Din acest motiv, diagnosticul microbiologic bazat pe cultură are valoare scăzută în aceste cazuri. Ca și în cazul infecțiilor cu CT, dezvoltarea tehnologiilor NAAT a îmbunătățit depistarea infecțiilor cu gonococ, aceste tehnici prezentând în mod evident o serie de avantaje în comparație cu metodele clasice de cultivare:

• deoarece este detectat ADN-ul bacterian nu este necesar ca microorganismul să fie viabil;
• prezintă o sensibilitate mai mare;
• la bărbați testul poate fi efectuat din urină, ceea ce crește complianța pacienților la investigație7.

Ca o concluzie la cele menționate mai sus, Chlamydia trachomatis (CT) și Neisseria gonorrhoeae (GC) sunt agenții patogeni cel mai frecvent implicați în bolilele cu transmitere sexuală de cauză bacteriana. Foarte important, coinfecția CT-GC este raportată în aproximativ 30% din cazuri (mai frecvent la femei) de unde și necesitatea testării combinate a celor doi patogeni.

Diagnosticul precoce al infecțiilor constituie o provocare deoarece o mare parte din persoanele afectate nu prezintă simptome. În absența diagnosticului și tratamentului pot conduce la infecții diseminate la bărbați și la boala inflamatorie pelvină la femei cu consecințe tardive semnificative: infertilitate, sarcină ectopică, durere pelvină cronică5;8. În cazul ambelor infecții este posibilă transmiterea perinatală cu dezvoltarea conjunctivitei la nou-născut. De asemenea, CT și GC se asociază cu risc crescut de transmitere a infecției HIV. Una din cele mai bune metode de a preveni complicațiile infecțiilor CT și GC este screening-ul adolescenților și adulților tineri precum și a femeilor gravide. Dacă o persoană este diagnosticată cu una sau ambele infecții toți partenerii sexuali trebuie testați și tratați corespunzător5.

Ghidul CDC (Centers for Disease Control and Prevention) recomandă ca screening-ul să se efectueze cu teste de amplificare a acizilor nucleici cu sensibilitate și specificitate înaltă, confirmând faptul că metodele moleculare constituie în prezent standardul de diagnostic al infecțiilor CT și GC4.

Metodele bazate pe tehnologia NAAT, disponibile în acest moment, includ reacțiile PCR (polymerase chain reaction), LCR (ligase chain reaction), SDA (strand displacement amplification) și TMA (transcription-mediated amplification)8. Folosirea pe scară din ce în ce mai largă a tehnologiei NAAT pentru detecția CT și NG a pus în evidență faptul că, așa cum a fost menționat mai sus, multe dintre infecțiile genitale sunt asimptomatice9.

În laboratorul nostru se utilizează metoda automatizată TMA care, spre deosebire de celelalte metode menționate ce se bazează pe amplificarea ADN-ului bacterian, amplifică ARN-ul ribozomal (ARNr). Testul APTIMA COMBO 2 permite detecția calitativă simultană a CT și GC și propune de asemenea o nouă abordare moleculară prin combinarea tehnologiilor “target capture”, TMA (Transcription Mediated Amplification) și DKA (Dual Kinetic Assay). Avantajul major al acestei metode, versus alte metode NAAT, constă în faptul că țintește moleculele de ARNr, acestea fiind prezente în celule într-un număr mai mare comparativ cu moleculele de ADN, ceea ce conduce la o creștere a sensibilității, reducând astfel riscul de rezultate fals negative.

Principiul metodei

Testul include 3 etape:

  • Captura țintei
  • Amplificarea
  • Detecția

Probele sunt colectate și transferate în tuburile de transport corespunzătoare. Soluțiile din aceste tuburi eliberează moleculele ARNr și le protejează de degradare în cursul stocării.

Captarea ARNr – molecula țintă – este efectuată cu ajutorul unor oligonucleotide de captură care se leagă de alte nucleotide prezente pe suprafața unor microparticule magnetice. Oligomerii de captură utilizează secvențe complementare regiunilor specifice ale moleculei țintă care se atașează de acestea în timpul etapei de hibridizare. Complexele astfel formate sunt separate magnetic și spălate de mai multe ori pentru îndepărtarea substanțelor care pot interfera sau pot inhiba reacția de amplificare ulterioară, reducându-se astfel riscul de rezultate fals negative.

Reacția de amplificare este bazată pe abilitatea primerilor (oligonucleotide) complementari de a se lega specific și de a facilita amplificarea enzimatică. Testul APTIMA permite replicarea unei secvențe specifice din regiunea 23S a ARNr pentru CT și 16S pentru GC. Pentru fiecare moleculă țintă este utilizat un set unic de primeri. Reacția TMA utilizează două enzime – ARN-polimeraza și revers-transcriptaza – amplificarea realizându-se în condiții izotermice, spre deosebire de tehnicile PCR. În prima etapă a procesului de TMA un primer promotor hibridizează cu ținta ARN ribozomal. Reverstranscriptaza recunoaște această secvență a primerului promotor și creează o copie ADN a ARN-ului țintă (cDNA, ADN complementar). Secvența de ARN din hibridul ADN: ARN va fi apoi eliminată prin activitatea de RNaza H a reverstranscriptazei. Un al doilea primer se leagă la molecula de cDNA, iar reverstranscriptaza va sintetiza o nouă catenă de ADN, rezultând o moleculă de ADN dublu catenar. ARN polimeraza recunoaște secvența promotor din catena ADN și inițiază transcripția (procesul de formare a ARN din ADN). Tot acest proces se repetă, formându-se milioane de ampliconi ARN în doar 60 de minute.

A treia etapă constă în detecția ampliconilor. După amplificare, va fi introdusă în reacție o sondă ADN marcată cu esteri de acridinium. Dacă ampliconul țintă este prezent, atunci va avea loc hibridizarea sondei și se va forma un complex stabil sondă – amplicon. Ulterior, se adaugă un reactiv de selecție care va elimina moleculele de acridinium nelegate. Următorul pas este hidroliza moleculelor de esteri de acridinium legate de complexele amplicon – sondă și producerea unui semnal luminos. In timpul etapei de detecție, lumina emisă de acești hibrizi este măsurată de un luminometru ca semnale de fotoni și raportată în RLU (relative light units).

Pentru fiecare din cele două ținte ARNr va fi utilizată câte o sondă ADN marcată cu esteri de acridium diferiți. Prin tehnologia DKA, diferențele între profilele cinetice ale sondelor CT și GC permit discriminarea semnalului detectat prin chemiluminescență. Rezultatele testului sunt stabilite cu ajutorul unui cut-off bazat pe valoarea totală RLU și tipul curbei cinetice detectate6.

Performanțele și avantajele testului APTIMA Combo 2

Caracteristicile de performanță ale testului APTIMA Combo 2 au fost stabilite în urma unui studiu muticentric desfășurat în America de Nord ce a inclus 2932 probe de urină și probe genitale recoltate pe tampon, de la persoane (1569 femei și 1363 bărbați) simptomatice și asimptomatice.

În cazul probelor recoltate pe tampon endocervical s-au raportat:

Pentru CT: 94.2% sensibilitate, 97.6% specificitate
Pentru GC: 99.2% sensibilitate, 99.6% specificitate

 iar în cazul utilizării probelor de urină la bărbați:

Pentru CT: 97.9% sensibilitate, 98.5% specificitate
Pentru GC: 98.5% sensibilitate, 99.6% specificitate6

Metoda TMA are cea mai înaltă sensibilitate dintre toate metodele bazate pe tehnologia NAAT, putând detecta cantități foarte mici de acizi nucleici în probă. Sensibilitatea testului APTIMA Combo 2 efectuat pe un număr mare de probe (1304 probe de urină și probe genitale recoltate pe tampon) s-a dovedit a fi net superioară sensibilității detecției prin culturi celulare sau a metodei DFA9. De asemenea, este singura tehnică în care s-a demonstrat că sensibilitatea testului efectuat din urină este echivalentă cu cea a testului efectuat din proba recoltată pe tampon10.

Metoda de identificare a CT/GC, patentată de compania GenProbe (SUA), permite într-o primă etapă capturarea moleculelor de ARN ribozomal cu ajutorul bilelor magnetice, ulterior realizându-se amplificarea acestora și detecția semnalului produs, folosindu-se tehnica DKA ce implică o cinetică diferită de emitere și respectiv de captare a luminii. Întreg procesul care are loc după introducerea tubului primar în analizor se realizează într-o manieră complet automată, evitând în acest fel posibilele contaminări sau erori introduse de utilizator. Datorită etapelor de spălare incluse la începutul procesului analitic, posibilitatea de a avea rezulte fals negative ca urmare a unor inhibitori sau factori de interferență (gonadotropina corionică umană, cristale, nitriți, hemoglobină) este practic exclusă. De asemenea, această metodă elimină reactivitatea încrucișată cu alte microorganisme ce ar putea fi prezente în tractul urogenital ca și posibilă pierdere a ADN-ului bacterian în timpul procesului de extracție, care poate afecta reacția de amplificare și conduce la rezultate fals-negative9.

Performanța testului APTIMA Combo 2 a fost verificată și pentru detecția tulpinilor mutante de Chlamydia trachomatis, rezultatele confirmând faptul că testul este capabil să identifice varianta suedeză CT care prezintă o deleție la nivelul plasmidei criptice și pe care unele teste comerciale nu o detectează11.

Toate aceste date confirmă acuratețea testului APTIMA Combo 2 și îl promovează ca pe un test de elită în diagnosticul molecular.

În laboratorul nostru, sunt utilizate ca tip de probe tamponul endocervical la femei și urina primul jet la bărbați. Așa cum s-a menționat mai sus, testarea probelor de urină prezintă o sensibilitate și specificitate foarte bune reprezentând o alternativă non-invazivă la analiza probelor uretrale6.

Recomandări pentru determinarea Chlamydia trachomatis – diagnosticul infecțiilor acute urogenitale, screening-ul infecției la persoanele cu risc crescut; screening-ul gravidelor în primul trimestru de sarcină (pentru gravidele ≤ 25 ani cât și pentru cele cu risc crescut de infecții CT și NG testarea va fi repetată și în trimestrul III; în cazul gravidelor la care s-a obținut un rezultat pozitiv în trimestrul I testarea va fi repetată după 3-6 luni)4;7.

Specimen recoltat – se vor recolta probe provenite din tractul urogenital: tampon endocervical pentru femei și urina primul jet pentru bărbați; pentru femei se vor utiliza tampoanele incluse în sistemele de recoltare furnizate de laborator (vezi figura 1).

Recoltarea probei endocervicale

Înainte de recoltarea propriu-zisa se va îndepărta mucusul în exces de la nivelul orificiul colului cu ajutorul tamponului cu tija albă inclus în kit (APTIMA CLEANING SWAB); se va introduce apoi celălalt tampon cu tija albastră (APTIMA COLLECTION SWAB) în canalul cervical, se va roti bland de 5 ori într-o singură direcție (10-30 secunde) după care se va retrage ușor, se va evita contactul cu mucoasa vaginală și se va introduce în tubul de transport; se va rupe tamponul în dreptul semnului, astfel că numai capătul tamponului va rămane în tubul de transport ce va fi închis etanș cu capacul. Tubul va fi etichetat corespunzător și trimis la laborator. Nu se va atinge capacul din folie de aluminiu al tubului.

Fiecare probă va fi ambalată separat în pungile speciale portocalii.

fig1chl

Fig. 1 Sistem de recoltare a probelor endocervicale

Recoltarea probei de urină

Înainte de recoltarea propriu-zisă pacientul nu trebuie să urineze timp de cel puțin 1 oră; apoi se recoltează într-un recipient de unică folosință prevăzut cu un capac etanș (de exemplu, paharul pentru urina din 24 ore furnizat de laborator) aproximativ 20-30 mL din primul jet de urină.

În decurs de 24 ore de la recoltare se vor transfera aproximativ 2 ml din probă de urină recoltată de pacient în tubul de transport din imaginea de mai jos. Pană atunci proba va fi menținută la 2-30ºC.

Transferul probei în tubul transport va fi efectuat la sediul laboratorului utilizand pipeta de plastic din kit. În cazul în care probele nu pot ajunge în laborator în decurs de 24 ore, colaboratorii Synevo vor solicita tuburi de transport în vederea transferării probelor în locațiile respective.

Pentru a se asigura un volum corect de urină nivelul lichidului trebuie să se situeze între cele două linii negre marcate cu săgeți pe eticheta tubului. Tubul va fi închis etanș și etichetat corespunzător. Pentru o bună omogenizare a urinei cu mediul stabilizator din tub se vor efectua 5 mișcări de inversiune a tubului, fără a se atinge capacul din folie de aluminiu al tubului.

Fiecare probă va fi ambalată separat în pungile speciale portocalii6.

fig2chl

Fig. 2 Sistem de transfer al probelor de urină

Stabilitate probă – 2 luni la temperaturi de 2-30ºC pentru probele endocervicale și pentru probele de urină stabilizate (transferate în tub)6.
Metodă – TMA (transcription mediated amplification); sunt folosite următoarele tipuri de controale: control pozitiv CT/control negativ GC și control pozitiv GC/control negativ CT6.

Limite de detecție

CT

Se raportează o sensibilitate analitică de 1 IFU/test (7.25 IFU/tampon și 5 IFU/mL urină). Cu toate acestea, în studii s-a constatat o pozitivitate de 100% și la diluții CT < 1 IFU/test.
IFU = unități de formare a incluziilor

NG

Se raportează o sensibilitate analitică de 50 celule/test (362 celule/tampon și 250 celule/mL urină)
Cu toate acestea, în studii s-a constatat o pozitivitate de 100% și la diluții GC < 50 celule/test6.

Valori de referință și raportarea rezultatelor

Chlamydia trachomatis (CT) ARNr nedetectabil
Neisseria gonorrhoeae (NG) ARNr nedetectabil
Rezultatele se raportează ca nedetectabil/pozitiv/echivoc. În cazul unui rezultat echivoc se retestează proba; dacă se obține tot un rezultat echivoc se recomandă repetarea recoltării probei.
Este posibil să se obțină și un rezultat invalid care indică o eroare în procesul analitic fiind necesară retestarea probei sau în unele cazuri, repetarea recoltării6.

Interpretarea rezultatelor, limite și interferențe

Un rezultat nedetectabil indică faptul că în proba testată nu este prezent ARNr pentru CT și/sau G; cu toate acestea nu este exclusă prezența unei infecții deoarece rata de detecție depinde de modul de recoltare a probei, cantitatea de ARN ribosomal din probă, absența inhibitorilor sau stadiul infecției.

Un rezultat pozitiv indică faptul că în proba testată este prezent ARNr pentru CT și/sau GC și constituie un indiciu puternic de infecție.

Valoarea predictivă pozitivă a testului este influențată însă de prevalența infecției într-o anumită populație sau grup. Astfel, în grupurile cu prevalență crescută a bolilor cu transmitere sexuală valoarea predictivă pozitivă este crescută. În schimb, în grupurile cu prevalență scăzută a acestor categorii de infecții, rezultatele pozitive trebuie atent interpretate în contextul clinic general al pacientului, luând în considerare și posibilitatea retestării prin alte metode (de exemplu, cultura pentru Neisseria gonorrheae).

Prezența mucusului în probele endocervicale nu interferă cu detecția CT și GC în testul APTIMA Combo 2, dar se recomandă înlăturarea excesului de mucus pentru a avea în probă o cantitate suficientă de celule endocervicale infectate cu CT. De asemenea prezența sângelui nu afectează performanța testului, decât dacă se găsește într-un procent mai mare de 10% (vol/vol) în probele endocervicale și mai mare de 30% (vol/vol) în probele de urină.

Pentru tampoanele endocervicale nu s-a pus în evidență interferența cu lubrifianți sau spermicide. De asemenea, pentru probele de urină nu s-au constatat interferențe cu prezența vitaminelor și mineralelor.

Performanța stabilită pentru probele de urină se bazează pe testarea primului jet de urină. Pentru alte tipuri de probe de urină performanța nu a fost evaluată.
Testul detecteaza și variantele de C. trachomatis lipsite de plasmide. Pentru GC nu s-au constatat reacții încrucișate cu speciile nepatogene de Neisseria prezente în orofaringe.

În general, testul nu se recomandă pentru aprecierea eficienței tratamentului antibiotic deoarece acizii nucleici din acești patogeni pot persista cel puțin 3 săptămâni după încheierea terapiei. După această perioadă de timp retestarea este utilă în cazul gravidelor, atunci când se suspectează o lipsă de complianță la tratament sau o reinfecție și în cazurile în care simptomatologia persistă6;12.

Bibliografie

1. Centers for Disease Control and Prevention. 2011. Sexually Transmitted Disease Surveillance 2010. Atlanta, GA: U.S. Department of Health and Human Services.
2. Betty A. Forbes, Daniel S. Sahm, Alice S. Weissfeld – Obligate Intracellular and Nonculturabile Bacterial Agents. Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology, 12th ed., 2007, 510-524.
3. Richard A. McPetersen, Matthew R. Pincus. Chlamydial, Rickettsial, and Mycoplasmal infections. In Henry’ Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods- Sauders Elsevier 21-Ed 2007- pg 1002, 1003.
4. Centers for Disease Control and Prevention, “Sexually Transmitted Diseases Treatment Guidelines 2010,” MMWR Recomm Rep, 2010, vol. 59(RR12):1-116.
5. Bernard M. Karnath. Manifestations of Gonorrhea and Chlamydial Infections. In Hospital Physician May/June 2009. www.turner-white.com.
6. Laborator Synevo. Referințe specifice tehnologiei de lucru utilizate 2014. Ref Type: Catalog.
7. Johnson RE, Newhall WJ, Papp JR, et al, “Screening Tests to Detect Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae,” MMWR Recomm Rep, 2002, 51(RR15):1-38.
8. Specialty Laboratories. Chlamydia trachomatis & Neisseria gonorrhoeae for symptomatic and asymptomatic patients. www.specialtylabs.com. Ref Type: Internet Communication.
9. B. Boyadzhyan, T. Yashina, J. H. Yatabe, M. Patnaik, and C. S. Hill. Comparison of the APTIMA CT and GC Assays with the APTIMA Combo 2 Assay, the Abbott LCx Assay, and Direct Fluorescent-Antibody and Culture Assays for Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae. In Journal of Clinical Microbiology, July 2004, Vol. 42, No. 7, 3089–93.
10. Crotchfelt, K. A., B. Pare, C. Gaydos, and T. C. Quinn. Detection of Chlamydia trachomatis by the Gen-Probe AMPLIFIED Chlamydia Trachomatis assay (AMP CT) in urine specimens from men and women and endocervical specimens from women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36:391-394.
11. Møller JK, Pedersen LN, and Persson K. Comparison of Gen-Probe Transcription-Mediated Amplification, Abbott PCR, and Roche PCR Assays for Detection of Wild-Type and Mutant Plasmid Strains of Chlamydia trachomatis in Sweden. J Clin Microbiol. 2008 December; 46(12): 3892–3895.
12. Mayo Clinic, Mayo Medical Laboratories. Reference Laboratory Services for Health Care Organizations. Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae by Nucleic Acid Amplification (GEN-PROBE). www.mayomedicallaboratories.com. 2014. Ref Type: Internet Communication.
< inapoi la lista

Pret 480.00 MDL