Мутации K-ras при опухолях толстой кишки

Ген KRAS (гомологичная онкогенная вирусная саркома крысы v-Ki-ras2), клеточный гомолог онкогена человека, выделенный из вируса саркомы крысы Кирстен, является частью семейства протоонкогенов RAS, включающего два других гена: HRAS и NRAS. Все гены RAS имеют сходную структуру интрон-экзон, а кодируемые белки представляют собой GTPases (G-белки, которые связывают GDP / GTP и действуют как внутриклеточные сигнальные преобразователи) и играют важную роль в процессах клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза. Мутации в генах RAS часто связаны с различными типами опухолей (20-30% всех опухолей человека); одной точечной мутации достаточно для превращения генов RAS в мощные онкогены1; 5.

В 1982 году Чанг и коллеги выделили клоны, соответствующие гену KRAS, из библиотек кДНК плаценты и эмбрионов человека; 2 изоформы, названные KRAS1 и KRAS2, были изолированы. Через год Маккой охарактеризовал ген KRAS, выделенный из клеточной линии аденокарциномы толстой кишки человека (SW480), и определил, что он соответствует изоформе KRAS2, идентифицированной Chang. Ген KRAS2 впоследствии был амплифицирован в нескольких линиях опухолевых клеток. В 1983 году Макграт клонировал гены KRAS1 и KRAS2, а KRAS1 был идентифицирован как псевдоген.

Ген KRAS2 имеет 6 экзонов, расположен на коротком плече хромосомы 12 и кодирует белок, состоящий из 188 аминокислот, с молекулярной массой 21,66 кДа; сравнение между двумя генами KRAS показало, что в случае KRAS1 некоторые последовательности вмешательства отсутствуют, из чего следует, что это псевдоген, скопированный из обработанной мРНК KRAS2 и встроенный в хромосому 6. Основная транскрипт мРНК KRAS2 имеет длину 5,5 т.п.н .

После альтернативного сплайсинга экзона 5 образуются две изоформы A и B, которые различаются в C-концевой области. В мРНК KRASB экзон 6 кодирует С-концевую область; в мРНК KRASA этот же экзон кодирует 3'-нетранслируемую область. Различные C-концевые области двух изоформ будут подвергаться посттрансляционным изменениям. Дифференцированный посттрансляционный процессинг имеет выраженные функциональные эффекты, ведущие к сигнальным путям и альтернативным локализациям белка5.

Белок K-Ras функционирует как «переключатель», который открывается и закрывается молекулами GTP и GDP, соответственно. В активном состоянии связывание GTP индуцирует прикрепление клеточной мембраны; Гидролиз ГТФ до ВВП позволяет вернуться в неактивную форму, диссоциации мембраны и инактивации передачи сигнала к ядру1. Белок K-ras рекрутируется активным рецептором EGFR для инициации сигнального каскада по пути RAS / MAPK4.

EGFR (рецептор эпидермального фактора роста) относится к семейству рецепторов тирозинкиназы для факторов роста. Представляет связь между внеклеточным пространством и внутриклеточной передачей сигнала; он состоит из внеклеточного рецептора, липофильного трансмембранного домена и внутриклеточного домена со свойствами тирозинкиназы. EGFR активируется внеклеточно лигандами, такими как EGF (эпидермальный фактор роста) или TGF-альфа (трансформирующий фактор роста - альфа), который вызывает гомодимеризацию рецептора. Результатом является аутофосфорилирование рецептора тирозинкиназы, которое запускает различные каскады передачи сигнала, в которых белок K-ras играет важную роль6.

Активирующие соматические мутации гена KRAS вызывают изменение одной аминокислоты и приводят к конститутивной активации белка K-ras, предотвращая гидролиз GTP (белок постоянно находится в активной форме, связанной с GTP). Активация белка K-Ras осуществляется после фосфорилирования тирозинкиназы EGFR; Кроме того, сигнальная трансдукция связана с RAF (фактор обилия корней), MEK (MAP-киназа, ERK-киназа) и ERK (внеклеточная регулируемая MAP-киназа), что в конечном итоге приводит к транскрипции генов, которые влияют на возникновение и прогрессирование опухолей. Это объясняет участие мутаций KRAS в нескольких типах рака, особенно поджелудочной железы, легких и колоректального рака2; 6.

Колоректальный рак, который включает злокачественные опухоли толстой кишки, прямой кишки и червеобразного отростка, является третьей наиболее распространенной формой рака и второй по значимости причиной смерти в соответствии с WHA (Всемирная ассоциация здравоохранения). Мутации KRAS были выявлены в 40% не наследственных колоректальных карцином, на которые приходится 90% всех колоректальных карцином. Исследования на пациентах из семей с наследственным не полипозным колоректальным раком (HNPCC) показали, что мутации гена KRAS не зависят от выявления нестабильности микросателлитов, а частота мутаций в случаях наследственной карциномы сравнима с частотой случайных случаев6. Мутации KRAS в большинстве случаев являются ранним событием в развитии и прогрессировании колоректального рака. Несколько исследований показали, что статус KRAS является важным прогностическим фактором. Таким образом, мутации KRAS связаны с более распространенными опухолями, с повышенным метастатическим потенциалом и низким прогнозом. На сегодняшний день зарегистрировано более 3000 точечных мутаций KRAS при колоректальном раке (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/). В большинстве случаев аномалии обнаруживаются в кодонах 12 (~ 82% всех мутаций KRAS) и 13 (~ 17%) экзона 2; похоже, что эти точечные мутации миссенс играют важную роль в прогрессировании рака толстой кишки2. Наиболее распространенные мутации: Gly12Asp, Gly12Ala, Gly12Val, Gly12Ser, Gly12Arg, Gly12Cys и Gly13Asp4.

Статус мутаций KRAS также влияет на терапевтические решения у пациентов с колоректальным раком. Учитывая важность оси EGFR, упомянутой выше, были разработаны лекарственные средства, которые влияют на функциональные домены рецептора; описаны два класса антагонистов EGFR: моноклональные антитела против EGFR, которые связываются с внеклеточным доменом EGFR и конкурируют с природными лигандами, блокирующими активацию рецептора, и небольшие молекулы ингибиторов тирозинкиназы EGFR, которые конкурируют с ATP- для связывания с внутриклеточным каталитическим доменом тирозинкиназы (см. фиг.1). В настоящее время два препарата анти-EGFR моноклональных антител были одобрены для лечения колоректального рака: цетуксимаб (химерное моноклональное антитело IgG1 человека и мышей) и панитумумаб (моноклональное антитело IgG2k человека). Было показано, что оба препарата снижают риск прогрессирования опухоли и улучшают общую выживаемость, выживаемость без прогрессирования и качество жизни у пациентов с резистентным к лечению колоректальным раком. Однако исследования показали, что не все пациенты реагируют на эти агенты с EGFR в качестве своей молекулярной мишени. Поскольку терапия дорогая и сопровождается побочными эффектами, важно определить пациентов, которые действительно могут извлечь из этого пользу.

В литературе содержится информация о том, что мутации в гене KRAS придают устойчивость к моноклональным антителам против EGFR; мутации связаны с плохим ответом на терапию, потому что они конститутивно активируют путь RAS / MAPK ниже по течению от EGFR, и терапия против EGFR, которая предотвращает связывание лиганда с EGFR, не может оказывать своего ингибирующего действия на пролиферацию клеток. В заключение следует отметить, что статус гена KRAS является важным параметром при отборе пациентов для терапии: пациенты с мутациями не могут получить пользу от терапии против EGFR. На основании этих данных Европейское агентство по лекарственным средствам (EMEA) одобрило использование цетуксимаба и панитумумаба при лечении метастатического рака у пациентов с геном KRAS дикого типа (нормальным) 2.

Мутации KRAS обнаруживаются с использованием молекулярных тестов на образцах опухолевой ткани, сохраненной в парафине6. Как правило, блок парафина, содержащий материал, полученный из аденомы или неинвазивного рака, не должен использоваться для проверки на мутации KRAS. Если эндоскопическая биопсия выполнена из первичной опухоли или из метастаза, патолог должен убедиться, что в отобранном материале есть опухолевые клетки и указать блок или слайды, которые будут использоваться в молекулярном тесте.

При тестировании мутаций KRAS методы ПЦР-амплификации используются на первом этапе; В зависимости от анализируемой ткани отношение опухолевой ткани к здоровой ткани является переменным и неоднородным, в результате чего амплифицируется смесь мишени, в которой ДНК мутанта и дикого типа не представлены в эквимолярном соотношении. Вот почему важно, чтобы для генотипирования выбранная ткань содержала достаточно опухолевого материала для анализа (более 70% клеток инвазивной карциномы). Впоследствии экзон 2 гена KRAS секвенируется для выявления мутаций2.

Рекомендации по анализу мутаций гена KRAS

Анализ мутаций гена KRAS вносит значительный вклад в отбор пациентов, которым может быть полезна терапия моноклональными антителами против EGFR. Генетический тест показан пациентам с метастатическими опухолями (стадия IV) 4; 6.
Собранный образец - рыхлые неокрашенные участки ткани, сохраненные в парафине (4-5 лезвий); с помощью маркера области, где присутствует опухолевая ткань, будут выделены3.
Метод - секвенирование экзонов 23.
Отчет о результатах
Будет сообщено о наличии или отсутствии мутации в кодоне 12 или 13 экзона 2 гена KRAS в ДНК, выделенной из ткани опухоли толстой кишки;

Пределы и помехи

Не все пациенты с геном KRAS дикого типа отвечают на терапию против EGFR. Описаны редкие полиморфизмы, которые могут привести к ложноположительным или ложноотрицательным результатам4.

Список используемой литературы
1. Генетика Главная Справочник. Гены. KRAS. http://ghr.nlm.nih.gov. Тип ссылки: Интернет-связь.
2. Юнг А, ван Крикен JHJM, Киршнер Т, Карнейро Ф, Серука Р, Босман Ф.Т., Квирк П, Флежу Дж. Ф., Платон Хнасен Т, Хертог Г., Ярес П., Лангнер С, Хофлер Г., Лигтенберг М, Тиниакос Д, Тейпар S, Bevilaqua G, Ensari A. KRAS мутационное тестирование для прогнозирования ответа на анти-EGFR терапию колоректального рака: предложение для европейской программы обеспечения качества. В Virchows Arch, 2008, 453: 417-431.
3. Synevo лаборатория. Конкретные ссылки на рабочую технологию, использованную в 2010 году. Тип ссылки: Каталог.
4. Клиника Майо. Медицинские лаборатории Майо. Тестовый каталог: KRAS Gene, 7 мутационная панель, опухоль. www.mayomedicallaboratories.com. Тип ссылки: Интернет-связь.
5. OMIM (онлайн-менделевское наследование в человеке). V-KI-RAS2 KIRSTEN RAT ONCOGENE VIRAL SARCOMA HOMOLOG; KRAS, http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Тип ссылки: Интернет-связь.
6. Стинцинг С., Хейнеманн В., Юнг А., Мусманн Н., Хиддеманн В., Киршнер Т. Лечение колоректальной карциномы моноклональными антителами. Важность анализа мутации KRAS и статуса EGFR. В Deutsches Arzteblat, 2009; 106 (12): 202-6