int(0)

Teste de laborator

Pachete de analize medicale

Planșa anatomică

Teste de la A la Z A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z
Teste Laborator
Product categories
Pachete analize Plansa anatomica
< inapoi la lista

Mutații K-ras în tumori de colon

Pret 8820.00 MDL

Ген KRAS (гомологичная онкогенная вирусная саркома крысы v-Ki-ras2), клеточный гомолог онкогена человека, выделенный из вируса саркомы крысы Кирстен, является частью семейства протоонкогенов RAS, включающего два других гена: HRAS и NRAS. Все гены RAS имеют сходную структуру интрон-экзон, а кодируемые белки представляют собой GTPases (G-белки, которые связывают GDP / GTP и действуют как внутриклеточные сигнальные преобразователи) и играют важную роль в процессах клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза. Мутации в генах RAS часто связаны с различными типами опухолей (20-30% всех опухолей человека); одной точечной мутации достаточно для превращения генов RAS в мощные онкогены1; 5.
В 1982 году Чанг и коллеги выделили клоны, соответствующие гену KRAS, из библиотек кДНК плаценты и эмбрионов человека; 2 изоформы, названные KRAS1 и KRAS2, были изолированы. Через год Маккой охарактеризовал ген KRAS, выделенный из клеточной линии аденокарциномы толстой кишки человека (SW480), и определил, что он соответствует изоформе KRAS2, идентифицированной Chang. Ген KRAS2 впоследствии был амплифицирован в нескольких линиях опухолевых клеток. В 1983 году Макграт клонировал гены KRAS1 и KRAS2, а KRAS1 был идентифицирован как псевдоген. Ген KRAS2 имеет 6 экзонов, расположен на коротком плече хромосомы 12 и кодирует белок, состоящий из 188 аминокислот, с молекулярной массой 21,66 кДа; сравнение между двумя генами KRAS показало, что в случае KRAS1 некоторые последовательности вмешательства отсутствуют, из чего следует, что это псевдоген, скопированный из обработанной мРНК KRAS2 и встроенный в хромосому 6. Основная транскрипт мРНК KRAS2 имеет длину 5,5 т.п.н .; После альтернативного сплайсинга экзона 5 образуются две изоформы A и B, которые различаются в C-концевой области. В мРНК KRASB экзон 6 кодирует С-концевую область; в мРНК KRASA этот же экзон кодирует 3′-нетранслируемую область. Различные C-концевые области двух изоформ будут подвергаться посттрансляционным изменениям. Дифференцированный посттрансляционный процессинг имеет выраженные функциональные эффекты, ведущие к сигнальным путям и альтернативным локализациям белка5.
Белок K-Ras функционирует как «переключатель», который открывается и закрывается молекулами GTP и GDP, соответственно. В активном состоянии связывание GTP индуцирует прикрепление клеточной мембраны; Гидролиз ГТФ до ВВП позволяет вернуться в неактивную форму, диссоциации мембраны и инактивации передачи сигнала к ядру1. Белок K-ras рекрутируется активным рецептором EGFR для инициации сигнального каскада по пути RAS / MAPK4.
EGFR (рецептор эпидермального фактора роста) относится к семейству рецепторов тирозинкиназы для факторов роста. Представляет связь между внеклеточным пространством и внутриклеточной передачей сигнала; он состоит из внеклеточного рецептора, липофильного трансмембранного домена и внутриклеточного домена со свойствами тирозинкиназы. EGFR активируется внеклеточно лигандами, такими как EGF (эпидермальный фактор роста) или TGF-альфа (трансформирующий фактор роста – альфа), который вызывает гомодимеризацию рецептора. Результатом является аутофосфорилирование рецептора тирозинкиназы, которое запускает различные каскады передачи сигнала, в которых белок K-ras играет важную роль6.
Активирующие соматические мутации гена KRAS вызывают изменение одной аминокислоты и приводят к конститутивной активации белка K-ras, предотвращая гидролиз GTP (белок постоянно находится в активной форме, связанной с GTP). Активация белка K-Ras осуществляется после фосфорилирования тирозинкиназы EGFR; Кроме того, сигнальная трансдукция связана с RAF (фактор обилия корней), MEK (MAP-киназа, ERK-киназа) и ERK (внеклеточная регулируемая MAP-киназа), что в конечном итоге приводит к транскрипции генов, которые влияют на возникновение и прогрессирование опухолей. Это объясняет участие мутаций KRAS в нескольких типах рака, особенно поджелудочной железы, легких и колоректального рака2; 6.
Колоректальный рак, который включает злокачественные опухоли толстой кишки, прямой кишки и червеобразного отростка, является третьей наиболее распространенной формой рака и второй по значимости причиной смерти в соответствии с WHA (Всемирная ассоциация здравоохранения). Мутации KRAS были выявлены в 40% не наследственных колоректальных карцином, на которые приходится 90% всех колоректальных карцином. Исследования на пациентах из семей с наследственным не полипозным колоректальным раком (HNPCC) показали, что мутации гена KRAS не зависят от выявления нестабильности микросателлитов, а частота мутаций в случаях наследственной карциномы сравнима с частотой случайных случаев6. Мутации KRAS в большинстве случаев являются ранним событием в развитии и прогрессировании колоректального рака. Несколько исследований показали, что статус KRAS является важным прогностическим фактором. Таким образом, мутации KRAS связаны с более распространенными опухолями, с повышенным метастатическим потенциалом и низким прогнозом. На сегодняшний день зарегистрировано более 3000 точечных мутаций KRAS при колоректальном раке (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/). В большинстве случаев аномалии обнаруживаются в кодонах 12 (~ 82% всех мутаций KRAS) и 13 (~ 17%) экзона 2; похоже, что эти точечные мутации миссенс играют важную роль в прогрессировании рака толстой кишки2. Наиболее распространенные мутации: Gly12Asp, Gly12Ala, Gly12Val, Gly12Ser, Gly12Arg, Gly12Cys и Gly13Asp4.
Статус мутаций KRAS также влияет на терапевтические решения у пациентов с колоректальным раком. Учитывая важность оси EGFR, упомянутой выше, были разработаны лекарственные средства, которые влияют на функциональные домены рецептора; описаны два класса антагонистов EGFR: моноклональные антитела против EGFR, которые связываются с внеклеточным доменом EGFR и конкурируют с природными лигандами, блокирующими активацию рецептора, и небольшие молекулы ингибиторов тирозинкиназы EGFR, которые конкурируют с ATP- для связывания с внутриклеточным каталитическим доменом тирозинкиназы (см. фиг.1). В настоящее время два препарата анти-EGFR моноклональных антител были одобрены для лечения колоректального рака: цетуксимаб (химерное моноклональное антитело IgG1 человека и мышей) и панитумумаб (моноклональное антитело IgG2k человека). Было показано, что оба препарата снижают риск прогрессирования опухоли и улучшают общую выживаемость, выживаемость без прогрессирования и качество жизни у пациентов с резистентным к лечению колоректальным раком. Однако исследования показали, что не все пациенты реагируют на эти агенты с EGFR в качестве своей молекулярной мишени. Поскольку терапия дорогая и сопровождается побочными эффектами, важно определить пациентов, которые действительно могут извлечь из этого пользу.
В литературе содержится информация о том, что мутации в гене KRAS придают устойчивость к моноклональным антителам против EGFR; мутации связаны с плохим ответом на терапию, потому что они конститутивно активируют путь RAS / MAPK ниже по течению от EGFR, и терапия против EGFR, которая предотвращает связывание лиганда с EGFR, не может оказывать своего ингибирующего действия на пролиферацию клеток. В заключение следует отметить, что статус гена KRAS является важным параметром при отборе пациентов для терапии: пациенты с мутациями не могут получить пользу от терапии против EGFR. На основании этих данных Европейское агентство по лекарственным средствам (EMEA) одобрило использование цетуксимаба и панитумумаба при лечении метастатического рака у пациентов с геном KRAS дикого типа (нормальным) 2.
Мутации KRAS обнаруживаются с использованием молекулярных тестов на образцах опухолевой ткани, сохраненной в парафине6. Как правило, блок парафина, содержащий материал, полученный из аденомы или неинвазивного рака, не должен использоваться для проверки на мутации KRAS. Если эндоскопическая биопсия выполнена из первичной опухоли или из метастаза, патолог должен убедиться, что в отобранном материале есть опухолевые клетки и указать блок или слайды, которые будут использоваться в молекулярном тесте.
При тестировании мутаций KRAS методы ПЦР-амплификации используются на первом этапе; В зависимости от анализируемой ткани отношение опухолевой ткани к здоровой ткани является переменным и неоднородным, в результате чего амплифицируется смесь мишени, в которой ДНК мутанта и дикого типа не представлены в эквимолярном соотношении. Вот почему важно, чтобы для генотипирования выбранная ткань содержала достаточно опухолевого материала для анализа (более 70% клеток инвазивной карциномы). Впоследствии экзон 2 гена KRAS секвенируется для выявления мутаций2.
Рекомендации по анализу мутаций гена KRAS
Анализ мутаций гена KRAS вносит значительный вклад в отбор пациентов, которым может быть полезна терапия моноклональными антителами против EGFR. Генетический тест показан пациентам с метастатическими опухолями (стадия IV) 4; 6.
Собранный образец – рыхлые неокрашенные участки ткани, сохраненные в парафине (4-5 лезвий); с помощью маркера кариоки области, где присутствует опухолевая ткань, будут выделены3.
Метод – секвенирование экзонов 23.
Отчет о результатах
Будет сообщено о наличии или отсутствии мутации в кодоне 12 или 13 экзона 2 гена KRAS в ДНК, выделенной из ткани опухоли толстой кишки;
Пределы и помехи
Не все пациенты с геном KRAS дикого типа отвечают на терапию против EGFR. Описаны редкие полиморфизмы, которые могут привести к ложноположительным или ложноотрицательным результатам4.
Список используемой литературы
1. Генетика Главная Справочник. Гены. KRAS. http://ghr.nlm.nih.gov. Тип ссылки: Интернет-связь.
2. Юнг А, ван Крикен JHJM, Киршнер Т, Карнейро Ф, Серука Р, Босман Ф.Т., Квирк П, Флежу Дж. Ф., Платон Хнасен Т, Хертог Г., Ярес П., Лангнер С, Хофлер Г., Лигтенберг М, Тиниакос Д, Тейпар S, Bevilaqua G, Ensari A. KRAS мутационное тестирование для прогнозирования ответа на анти-EGFR терапию колоректального рака: предложение для европейской программы обеспечения качества. В Virchows Arch, 2008, 453: 417-431.
3. Синевская лаборатория. Конкретные ссылки на рабочую технологию, использованную в 2010 году. Тип ссылки: Каталог.
4. Клиника Майо. Медицинские лаборатории Майо. Тестовый каталог: KRAS Gene, 7 мутационная панель, опухоль. www.mayomedicallaboratories.com. Тип ссылки: Интернет-связь.
5. OMIM (онлайн-менделевское наследование в человеке). V-KI-RAS2 KIRSTEN RAT ONCOGENE VIRAL SARCOMA HOMOLOG; KRAS, http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Тип ссылки: Интернет-связь.
6. Стинцинг С., Хейнеманн В., Юнг А., Мусманн Н., Хиддеманн В., Киршнер Т. Лечение колоректальной карциномы моноклональными антителами. Важность анализа мутации KRAS и статуса EGFR. В Deutsches Arzteblat, 2009; 106 (12): 202-6

SKU: BM92 Durata 14 zile biopsie tesut (bloc de parafina)

Gena KRAS (v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog), omologul celular uman al oncogenei izolate din virusul Kirsten al sarcomului şobolanului, face parte din familia RAS de proto-oncogene care include şi două alte gene: HRAS şi NRAS. Toate genele RAS au o structură intron-exon similară, iar proteinele codificate sunt GTP-aze (proteine G care leagă GDP/GTP şi acţionează ca transductori ai semnalului intracelular) cu rol important în procesele de proliferare, diferenţiere şi apoptoză celulară. Mutaţiile genelor RAS sunt frecvent asociate cu diverse tipuri de tumori (20-30% din totalul tumorilor umane); este suficientă o singură mutaţie punctiformă pentru a transforma genele RAS în oncogene potente1;5.

In 1982 Chang şi colaboratorii săi au izolat clonele corespunzătoare genei KRAS din băncile de ADNc placentar şi embrionar uman; au fost izolate 2 izoforme denumite KRAS1 şi KRAS2. Un an mai târziu McCoy a caracterizat gena KRAS izolată din linia celulară umană de adenocarcinom de colon (SW480) şi a stabilit că aceasta corespunde izoformei KRAS2 identificată de Chang. Ulterior gena KRAS2 a fost amplificată în câteva linii celulare tumorale. In 1983 McGrath a clonat genele KRAS1 şi KRAS2, KRAS1 fiind identificată ca pseudogenă. Gena KRAS2 are 6 exoni, este localizată pe braţul scurt al cromozomului 12 şi codifică o proteină alcătuită din 188 aminoacizi, cu o masă moleculară de 21.66 kDa; comparaţia între cele 2 gene KRAS a demonstrat că în cazul KRAS1 lipsesc anumite secvenţe de intervenţie, concluzia fiind că aceasta este o pseudogenă copiată dintr-un ARNm procesat al KRAS2 şi încorporată în cromozomul 6. Transcriptul ARNm  KRAS2 major are o lungime de 5.5 kb; în urma splicing-ului alternativ al exonului 5 se formează două izoforme A şi B care diferă în regiunea C-terminal. In ARNm KRASB exonul 6 codifică regiunea C-terminală; în ARNm KRASA acelaşi exon codifică regiunea netranslatată 3’. Regiunile C-terminale diferite ale celor două izoforme vor suferi modificări post-translaţionale. Procesarea post-tanslaţională diferenţiată are efecte funcţionale marcate ce conduc la căi de semnalizare şi localizări alternative ale proteinei5.

Proteina K-Ras funcţionează ca un “comutator” ce este deschis şi închis de către moleculele de GTP şi respectiv GDP. In stare activă, legarea GTP induce ataşarea de membrana celulară; hidroliza GTP la GDP permite revenirea la forma inactivă, disocierea de membrană şi inactivarea transmiterii semnalului la nucleu1. Proteina K-ras este recrutată de către receptorul EGFR activ pentru a iniţia cascada de semnalizare pe calea RAS/MAPK4.

EGFR (epidermal growth factor receptor = receptorul pentru factorul de creştere epidermică) aparţine familiei de receptori tirozin kinazici pentru factori de creştere. Reprezintă veriga de legătură între spaţiul extracelular şi transducţia intracelulara a semnalului; este alcătuit dintr-un receptor extracelular, un domeniu transmembranar lipofilic şi un domeniu intracelular cu proprietăţi de tirozin kinaza. EGFR este activat extracelular de către liganzi cum ar fi EGF (epidermal growth factor = factor de creştere epidermică) sau TGF-alfa (transforming growth factor – alpha = factorul transformator al creşterii), ce determină homodimerizarea receptorului. Rezultă autofosforilarea receptorului tirozin kinazic care declanşează diverse cascade de transmitere a semnalului în care proteina K-ras joacă un rol important6.

Mutaţiile somatice activatoare ale genei KRAS determină schimbarea unui singur aminoacid şi conduc la activarea constitutivă a proteinei K-ras, prin impiedicarea hidrolizei GTP (proteina se găseşte permanent în forma activă legată de GTP). Activarea proteinei K-Ras se face în aval de fosforilarea tirozin kinazei EGFR; în continuare transducţia semnalului este legată de RAF (root abundant factor), MEK (MAP kinaza, ERK kinaza) şi ERK (extracellular regulated MAP-kinaza), ce conduce în final la transcripţia genelor care influenţează apariţia şi progresia tumorilor. Astfel se explică implicarea mutaţiilor KRAS în mai multe tipuri de cancer, în special pancreatic, pulmonar şi colorectal2;6.

Cancerul colorectal, ce include tumorile maligne de la nivelul colonului, rectului şi apendicelui, este a treia cea mai frecventă formă de cancer şi a doua cauză de deces conform WHA (World Health Asssociation). Mutaţii KRAS au fost identificate în 40% din carcinoamele colorectale non-ereditare, ce constituie 90% din totalul carcinoamelor colorectale. Studii efectuate pe pacienţii proveniţi din familii cu cancer colorectal non-polipozic ereditar (HNPCC) au demonstrat că mutaţiile genei KRAS sunt independente de detectarea instabilităţii microsatelite, iar frecvenţa mutaţiilor în cazurile de carcinom ereditar este comparabilă cu cea din cazurile sporadice6. Mutaţiile KRAS constituie în majoritatea cazurilor un eveniment precoce în dezvoltarea şi progresia cancerelor colorectale. Câteva studii au demonstrat că statusul KRAS este un factor important de prognostic.  Astfel, mutaţiile KRAS sunt asociate cu tumori în stadiu mai avansat, cu un potenţial metastatic crescut şi cu un prognostic scăzut. Până în prezent au fost comunicate peste 3000 de mutaţii punctiforme KRAS în cancerul colorectal (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/). In majoritatea cazurilor anomaliile sunt detectate în codonii 12 (~82% din toate mutaţiile KRAS) şi 13 (~17%) ai exonului 2; se pare că aceste mutaţii punctiforme missense au un rol important în progresia cancerului de colon2. Mutaţiile cele mai obişnuite sunt următoarele: Gly12Asp, Gly12Ala,Gly12Val, Gly12Ser, Gly12Arg, Gly12Cys şi Gly13Asp4.

Statusul mutaţiilor KRAS are de asemenea impact şi asupra deciziilor terapeutice la pacienţii cu cancer colorectal. Luând în considerare importanţa axei EGFR menţionate mai sus, au fost dezvoltate medicamente care interferă cu domeniile funcţionale ale receptorului; sunt descrise astfel două clase de antagonisti EGFR: anticorpi monoclonali anti-EGFR, care se leagă de domeniul extracelular EGFR şi intră în competiţie cu liganzii naturali blocand activarea receptorului, şi molecule mici de inhibitori ai tirozin kinazei EGFR, care intră în competiţie cu ATP-pentru legarea domeniului catalitic intracelular al tirozin kinazei (vezi figura 1). La ora actuală au fost aprobate două preparate de anticorpi monoclonali anti-EGFR în tratmentul cancerului colorectal: Cetuximab (un anticorp monoclonal IgG1 chimeric provenit de la om şi şoarece) şi Panitumumab (un anticorp monoclonal IgG2k uman). A fost dovedit că ambele preparate reduc riscul de progresie a tumorii şi îmbunătăţesc supravieţuirea globală, perioada de supravieţuire fără progresie a bolii, precum şi calitatea vieţii la pacienţii cu cancer colorectal refractar la tratament. Cu toate acestea, studiile au arătat că nu toţi pacienţii răspund la aceşti agenţi care au drept ţintă moleculară EGFR. Deoarece terapia este costisitoare şi este însoţită de reacţii adverse este esenţial să se identifice pacienţii care pot beneficia într-adevăr de aceasta2;4;6.

Literatura de specialitate furnizează informaţii conform cărora mutaţii în gena KRAS conferă rezistenţă faţă de anticorpii monoclonali anti-EGFR; mutaţiile sunt asociate cu răspuns slab la terapie deoarece acestea activează constitutiv calea RAS/MAPK în aval de EGFR, iar terapia anti-EGFR care împiedică legarea ligandului la EGFR nu îşi poate exercita efectul inhibitor asupra proliferării celulare. Concluzionând, statusul genei KRAS este un parametru important în selectarea pacienţilor pentru terapie: pacienţii cu mutaţii nu pot beneficia de terapia anti-EGFR. Pe baza acestor date, Agentia Europeana a Medicamentului (EMEA) a aprobat folosirea cetuximabului şi panitumumabului în tratamentul cancerelor metastatice la pacienţii care au gena KRAS de tip sălbatic (normală)2.

Mutaţiile KRAS sunt detectate cu ajutorul unor teste moleculare pe probe de ţesut tumoral conservat în parafină6. In general, un bloc de parafină care conţine un material ce provine de la un adenom sau de la un carcinom neinvaziv nu trebuie folosit pentru testarea mutaţiilor KRAS. In cazul în care se efectuează o biopsie pe cale endoscopică din tumora primară sau dintr-o metastază patologul trebuie să se asigure că există celule tumorale în materialul prelevat şi să indice blocul sau lamele care trebuie utilizate în ţestul molecular.

Mutații K-ras în tumori de colon - Synevo

Mutații K-ras în tumori de colon - Synevo

Fig. 1 Căile de transducţie controlate de activarea EGFR şi blocarea terapeutică a EGFR; activarea EGFR indusă de ligand duce la activarea a trei căi de transducţie importante, RAS-MAPK, PI3K-Akt şi STAT, care controlează transcripţia, progresia, proliferarea celulară, adeziunea, angiogeneza şi migrarea celulară. Anticorpii monoclonali anti-EGFR se leagă de domeniul specific extracelular al receptorului, inhibă legarea ligandului şi automat activarea EGFR. Molecule inhibitoare ale EGFR inhibă fosforilarea, activarea căilor de transducţie şi implicit proliferarea celulară(Adaptare dupa Ensari et al.)

In cadrul testării mutaţiilor KRAS se folosesc în primă etapa tehnici de amplificare PCR; în funcţie de ţesutul analizat, raportul ţesut tumoral versus ţesut sănătos este variabil şi heterogen, rezultând un amestec al ţintei de amplificat în care ADN-ul mutant şi cel sălbatic nu sunt prezente într-un raport echimolar. De aceea este important ca pentru genotipare ţesutul selectat să conţină suficient material tumoral pentru analiza (mai mult de 70% celule de carcinom invaziv). Ulterior are loc secvenţierea exonului 2 al genei KRAS în vederea detectării mutaţiilor2.

Recomandări pentru analiza mutaţiilor genei KRAS

Analiza mutaţiilor genei KRAS contribuie semnificativ la selectarea pacienţilor care pot beneficia de terapia cu anticorpi monoclonali anti–EGFR. Testul genetic se indică la pacienţii cu tumori metastatice (stadiul IV)4;6.

Specimen recoltat – secţiuni nefixate, necolorate din ţesut  conservat în parafină (4-5 lame); cu ajutorul unui marker cariocă vor fi evidenţiate zonele în care este prezent ţesutul tumoral3.

Metodasecvenţierea exonului 23.

Raportarea rezultatelor

Va fi comunicată prezenţa sau absenţa unei mutaţii la nivelul codonului 12 sau 13 din exonul 2 al genei KRAS în ADN-ul extras din ţesutul tumoral colonic3;4.

Limite şi interferente

Nu toţi pacienţii care prezintă gena KRAS de tip sălbatic răspund la terapia anti-EGFR. Au fost descrise polimorfisme rare care pot conduce la rezultate fals-pozitive sau fals-negative4.

 

Bibliografie

1. Genetics Home Reference. Genes. KRAS. http://ghr.nlm.nih.gov. Reference Type: Internet Communication.
2. Jung A, van Krieken JHJM, Kirchner T, Carneiro F, Seruca R, Bosman FT, Quirke P, Flejou JF, Plato Hnasen T, Hertogh G, Jares P, Langner C, Hoefler G, Ligtenberg M, Tiniakos D, Tejpar S, Bevilaqua G, Ensari A. KRAS mutation testing for predicting response to anti-EGFR therapy for colorectal carcinoma: proposal for an European quality assurance program. In Virchows Arch, 2008, 453: 417-431.
3. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.
4. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: KRAS Gene, 7 Mutation Panel, Tumor. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
5. OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man). V-KI-RAS2 KIRSTEN RAT SARCOMA VIRAL ONCOGENE HOMOLOG; KRAS, http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Reference Type: Internet Communication.
6. Stintzing S, Heinemann V, Jung A, Moosmann N, Hiddemann W, Kirchner T, The Treatment of Colorectal Carcinoma With Monoclonal Antibodies – The Importance of KRAS Mutation Analysis and EGFR Status. In Deutsches Arzteblat, 2009; 106(12): 202-6
< inapoi la lista

Pret 8820.00 MDL