Profil boli hepatice autoimune – Blot

Anti-SLA au fost descriși în 1987 ca fiind îndreptați împotriva  unei proteine din citosol care se găsește în concentrații crescute în țesutul hepatic și renal. Anti-LP au fost descriși înaintea anti-SLA (1981), de către un grup diferit de cercetători, ca având reactivitate față de o proteină solubilă dintr-un lizat omogen de ficat și pancreas. Ulterior s-a demonstrat  că anti-SLA si anti-LP sunt  identici (anti SLA/LP) și că antigenul țintă este reprezentat de o proteină citosolică de 50 kDa ce este implicată în biosinteza seleno-proteinelor (UGA-suppressor serine-tRNA-associated protein). Acești anticorpi sunt înalt specifici pentru AIH  având o prevalență de 10-30%1;2;6.

Anti-LC1 apar in AIH tip II, fiind detectați la 50% din serurile LKM  positive. Unii autori  îl asociază cu ANA și ASMA și  de asemenea cu  hepatita cronică cu virus C. Ei  recunosc ca antigen țintă  formiminotransferaza-ciclodeaminaza  și se corelează cu activitatea bolii2;6;7.

Alți  anticorpi care  mai pot apărea în AIH sunt :

p-ANCA atipici
anti-LKM3 (ținta antigenică este reprezentată de de uridin-difosfat glucuronoziltransferaza și sunt întâlniți la pacienți cu hepatită cronică D și AIH tip II)
anti-LKM2 (îndreptați împotriva CYP2C9 și asociați cu  hepatita  la ticrynafen)
anti-receptor pentru asialoglicoproteine (ASGP-R, sunt întâlniți atât la pacienți cu AIH cât și cu hepatită virală; se corelează cu activitatea histologică)1.

Diversitatea serologică  a anticorpilor a condus la ipoteza că AIH reprezintă un grup heterogen de boli. Această ipoteză este susținută de asocierea  în 10-18 % din cazuri a unui sindrom multiorganic (APECED) caracterizat prin candidiază mucocutanată cronică, distrofie ectodermală și distrucție tisulară autoimună a diferitelor glande endocrine (hipoparatiroidism, insuficiență suprarenaliană, hipogonadism)1;7.

Ciroza  biliară primitivă (PBC)  apare în 90% din cazuri la femei de vârstă mijlocie. Incidența bolii în diferite regiuni ale lumii este de 4-31 cazuri /1 million locuitori/an. Clinic, pacienții prezintă fatigabilitate, prurit, artralgii, dureri abdominale, icter obstructiv intermitent. Patognomonici  pentru această afecțiune  sunt anticorpii antimitocondriali (AMA) care  apar la 95% din pacienți. Ei sunt îndreptați asupra subunității E2  a complexului piruvat dehidrogenazei (PDC-E2). Acest  antigen  este exprimat  la nivel hepatic,  în jurul ductelor biliare, iar autoanticorpii vor duce la distrucția canaliculelor biliare cu colestază secundară. Diagnosticul PBC este luat în considerare  dacă:

1. testele  de colestază sunt pozitive (ALP, GGT)
2. AMA sunt   pozitivi
3. examenul histopatologic este sugestiv (colangită cronică non-supurativă  cu distrucție progresivă  a ductelor  biliare  și fibroză)

Boala poate afecta atât ficatul cât și glandele cu funcție exocrină (glande salivare, lacrimale, pancreas). Titrurile AMA crescute   susțin diagnosticul de PBC și pot avea  valoare predictivă pentru dezvoltarea  ulterioară de PBC  la pacienți cu simptome  de  colestază. AMA mai pot fi detectați și în sindroame  overlap PBC-AIH, scleroza sistemică (6%) și sindromul  Sjögren1;4;5.

Alți  autoanticorpi  specifici  PBC sunt:

Anti-gp210    recunosc un antigen de 210 kDa  al membranei  nucleare și apar la 10-47% din pacienții cu PBC.

Anti-Sp100 apar  la  20% din pacienții cu PBC  și sunt îndreptați împotriva   unor structuri  numite corpi nucleari (“nuclear  dots”) care în imunofluorescența indirectă prezintă un aspect punctat și care au fost puși în evidență pentru prima dată în  nucleii celulelor maligne. Acești corpi nucleari  ce conțin fibre non-cromatiniene   reprezintă un complex alcătuit din următoarele componente: antigenul sp100, antigenul PML (promyelocytic leukemia factor), LYSP 100, NDP55 și NDP 53.

Anti-NUP62 (Nucleoporina p62)  apar în  32% din cazurile de PBC.

Mai puțin specifici pentru PBC sunt anticorpii anti receptor lamin B și anti-ciclină A.

În tabelul de mai jos este menționată sensibilitatea și specificitatea diverselor tipuri de autoanticorpi pentru PBC:

 Tratamentul PBC  impune reducerea colestazei și îmbunătățirea  funcției hepatice; constă în administrarea de acid ursodeoxicolic și colestiramină. În cazuri severe este indicat transplantul hepatic1;3;6.

O situație aparte este reprezentată de  sindroamele overlap PBC-AIH în care anticorpii AMA  se asociază  cu  cei din AIH (10-20% din cazuri). Aceste sindroame pot coexista de la început (PBC-AIH) sau PBC poate progresa  către AIH. Identificarea sindroamelor overlap este foarte importantă datorită eficacității dovedite a tratamentului corticosteroid. Pentru diagnosticul sindroamelor overlap AIH-PBC  au fost elaborate criteriile Paris5:

Colangita sclerozantă  primitivă (PSC) apare cu o incidență de  4 cazuri la 100 000 locuitori/an. Tabloul clinic este dominat de simptomele și semnele de colestază. Diagnosticul  se bazează pe  modificările testelor de laborator, examenul histologic și  colangiopancreatografia  endoscopică retrogradă (ERCP). Sunt afectați în principal bărbații iar în 50% din cazuri se asociază  și colita ulceroasă. Autoanticorpii identificați în această  afecțiune  sunt  p-ANCA cu aspect atipic în imunofluorescența indirectă, îndreptați impotriva antigenelor: catepsină G, lactoferină, catalază, alfa-enolază. Aceștia  pot apărea  ocazional și  în AIH  și  PBC1;4.

Recomandări –  pacienți cu suspiciune clinică de boli hepatice autoimune1.

Pregătire pacient – à jeun (pe nemâncate) sau postprandial (după mese)7.

Specimen recoltat – sânge venos7.

Recipient de recoltare – vacutainer fără anticoagulant cu/fără gel separator7.

Prelucrare necesară după recoltare – se separă serul prin centrifugare7.

Volum probă – minim 1 mL ser7.

Cauze de respingere a probei:

• specimen hemolizat;
• specimen icteric, lipemic;
• specimen contaminat bacterian7.

Stabilitate probă – serul separat este stabil 14 zile la 2-8ºC și timp îndelungat la -20ºC. Nu decongelați/recongelați6.

Metodă – imunoblot. Testul utilizează 9 antigene native și recombinate purificate, care sunt fixate  în cip-uri paralele pe membrana unui strip. Antigenele sunt reprezentate, în ordinea fixării pe strip, de:

– AMA M2: antigen nativ purificat
– M2-3E (BPO): antigen recombinat ce cuprinde domeniile imunogenice ale subunitățiii E2
– Sp100: antigen recombinat
– PML: antigen recombinat
– GP210: antigen recombinat
– LKM1: antigen recombinat
– LC-1: antigen recombinat
– SLA/LP: antigen recombinat
– Ro 52: antigen recombinat

Într-o primă etapă strip-ul încărcat cu antigenele purificate este incubat împreună cu serul diluat al pacientului. Dacă în ser sunt prezenți anticorpi specifici aceștia se vor lega de antigenele corespunzătoare de pe strip. După o etapă de spălare, strip-ul este incubat cu un conjugat anti-IgG uman marcat cu fosfataza alcalină. Conjugatul se va atașa la porțiunea IgG a complexului antigen-anticorp. După îndepărtarea prin spălare a conjugatului nelegat se adaugă soluția de colorare (substratul enzimei) – un sistem de detecție enzimatică colorimetrică . Dacă este prezent conjugatul legat reacția enzimatică va genera un produs colorat albastru-închis la nivelul benzilor ocupate de anticorpi specifici. Astfel, benzile vizualizate la nivelul stripului sunt rezultatul legării  anticorpilor specifici de antigenele individuale de la nivelul strip-ului.

Pe fiecare strip  există o bandă de control intern. Apariția unei reacții de culoare intense la acest nivel certifică faptul că toate etapele testului imunoblot au fost executate corect7.

Valori de referință  și interpretarea rezultatelor

Interpretarea definitivă a rezultatelor testului se face cu ajutorul unui software (după scanarea strip-urilor) care în funcție de intensitatea semnalului, acordă un punctaj pentru fiecare bandă a strip-ului, astfel:

În final este calculată suma  punctelor acordate și se va genera rezultatul testului.
Un rezultat pozitiv confirmă prezența anticorpilor specifici .
Un rezultat echivoc indică faptul că prezența auto- anticorpilor  este incertă; în funcție de contextul clinic al pacientului testul va fi repetat la un interval de 1-2 luni.
Un rezultat negativ indică absența auto-anticorpilor specifici.

Valori de referință

Anti-AMA M2: negativ
Anti-M2-3E: negativ
Anti-sp100: negativ
Anti-PML: negativ
Anti-gpP210: negativ
Anti-LKM 1: negativ
Anti-LC1: negativ
Anti-SLA/LP: negativ
Anti-Ro 52: negativ7

Bibliografie

1.   A. J. Czaja. Autoantibodies as prognostic markers in autoimmune liver disease. In  Digestive Diseases and Sciences, vol. 55,  no. 8, pp. 2144–2161, 2010.
2.   Ashima Makol et al. Autoimmune Hepatitis: A Review of Current Diagnosis and Treatment. In Hepatitis Research and Treatment, volume 2011 (2011).
3.   Christian P. Strassburg. Autoantibodies and Autoantigens in Autoimmune Hepatitis. In Semin Liver Dis. 2002 Nov;22(4):339-52.
4.   D.P. Bogdanos. Autoimmune liver serology: current diagnostic and clinical challenges. In World Journal of Gastroenterology, 2008, 14(21):3374-87.
5.   Edith Kuiper. Primary billiary cirrhosis: Diagnostic and Therapeutic Aspects. Erasmus University Medical Centre Rotterdam.
6.  Kalliopi Zachou, et al. Autoantibodies and autoantigens in autoimmune hepatitis: important tools in clinical practice. In Journal of Autoimmune Diseases, 2004, 2: 1740-1757.
7.   Laborator Synevo. Referințele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2012. Ref Type: Catalog.