int(0)

Teste de laborator

Pachete de analize medicale

Planșa anatomică

Teste de la A la Z A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z
Teste Laborator
Product categories
Pachete analize Plansa anatomica
< inapoi la lista

Bursttest (explozia oxidativă a neutrofilului)

Pret 1260.00 MDL

Нейтрофилы играют важную роль в неспецифическом иммунном ответе, особенно в антибактериальной резистентности, в качестве эффекторных, индуцирующих и регуляторных клеток. Среди их существенных особенностей:
• маргинализация и адгезия к эндотелиальным клеткам сосудов;
• пересечение сосудистой стенки (диапедез) и миграция в очаги воспаления;
• распознавание и фагоцитоз опсонизированных молекул;
• разрушение и разрушение этих молекул в результате образования токсичных кислородных радикалов.
Этим особенностям способствует присутствие рецепторов на поверхности и внутри клеток, таких как рецепторы цитокинов, нейротрансмиттеры, аутокоиды и гормоны.
Нейтрофильный хемотаксизм возникает в ответ на хемотаксические факторы (хемотаксины), генерируемые в очаге поражения. Кроме того, хемотаксины усиливают метаболизм нейтрофилов, их агрегацию и бактерицидное действие.
Фагоцитоз опосредуется циркулирующими опсонинами, специфическими (иммуноглобулины IgG) или неспецифическими (компоненты комплемента), нейтрофилами, имеющими рецепторы для фрагмента Fc иммуноглобулинов IgG1, IgG2 и для фрагмента комплемента iC3b (инактивированный C3b). Поглощенные и опсонизированные микроорганизмы уничтожаются как кислородзависимыми, так и независимыми от кислорода механизмами. Свободные радикалы кислорода разлагают бактерии, поглощенные фагосомами, и частично высвобождаются в окружающую среду, где они усиливают разрушение микроорганизмов и одновременно вызывают повреждение тканей. Процесс характерен для острого воспаления, гораздо реже при хронических воспалительных заболеваниях. Разрушение микроорганизмов также может происходить через белки, присутствующие в азурофильных грануляциях, такие как катепсин G, лизоцим, интерфероны и т. Д
Медиаторы воспаления, цитокины (например, TNFα) и селектины увеличивают способность гранулоцитов локализоваться в месте воспаления. Способность к фагоцитозу увеличивается за счет усиления выработки кислородных радикалов и высвобождения лизосомальных ферментов. TNFα является важным фактором, который усиливает фагоцитарную и цитотоксическую активность нейтрофилов. В свою очередь, активированные гранулоциты секретируют цитокины; IL-1, который стимулирует выработку IL-8 моноцитами, эндотелиальными клетками и фибробластами, увеличивает экспрессию молекул адгезии CD11b / CD18 и образование радикалов кислорода. Гамма-интерферон является мощным цитокином, который усиливает экспрессию Fc-рецепторов, стимулирует изменения кислорода, а также высвобождение гранул из нейтрофилов1.
Благодаря упомянутым характеристикам гранулоциты участвуют в раннем воспалительном ответе, и их функциональные аномалии, возникающие на любом из этапов, определяют значительные недостатки клеточного иммунитета5.
Снижение или отсутствие активности генерации окислительного взрыва в нейтрофилах или моноцитах обнаруживается при некоторых наследственных дефектах, таких как хроническое гранулематозное заболевание (ХГБ). CGD представляет собой гетерогенную группу Х-связанных или аутосомно-рецессивных заболеваний, основанную на множественных генетических мутациях. В результате этих аномалий затрагивается одна из четырех субъединиц фермента NADPH оксидазы, который катализирует образование перекиси водорода. Процесс фагоцитоза протекает нормально, но окислительный метаболизм нарушается – молекулярный кислород больше не восстанавливается до супероксидного аниона и других свободных радикалов (гидроксильный радикал и перекись водорода), которые являются важными компонентами внутриклеточного механизма уничтожения бактерий.
Пациенты с CGD имеют рецидивирующие инфекции с продуцирующими каталазу микроорганизмами, такими как Staphylococcus aureus, которые способны разрушать перекись кислорода, генерируемую нейтрофилами. Эти микроорганизмы выживают при внутриклеточном проглатывании, размножаются и вызывают гранулематозную реакцию со стороны тканей, которая при чрезмерном количестве может препятствовать желудочно-кишечному и мочеполовому тракту. Другими органами, которые могут быть затронуты гранулемами, являются легкие, лимфатические узлы, печень, кости. Особенно проблематичны хронические инфекции с видами Serratia, Klebsiella, Burkholderia cepacia и Aspergillus. Следует отметить, что пациенты с ХГБ не страдают от инфекций с каталазо-негативными микроорганизмами. Начало заболевания обычно происходит в первые два года жизни2; 3; 4.
Окислительный взрыв нейтрофилов может быть затронут как у пациентов с трансплантацией, так и у больных СПИДом.
Некоторые иммуномодуляторы (цитокины: GM-CSF, G-CSF, TNFα) могут оказывать некоторое влияние на клеточный окислительный метаболизм4.
Основная характеристика нейтрофилов при ХГП заключается в том, что после стимуляции они не способны произвести значительный окислительный взрыв. Классический метод скрининга на это состояние использует краситель – нитрат синего тетразола (нитроблюум тетразолий – тест NTB), который инкубируют с стимулированными нейтрофилами пациента; функциональные нейтрофилы фагоцитоз, уменьшают и осаждают желтый краситель NTB, что приводит к внутриклеточным отложениям черно-синего формазана; эти отложения представляют собой показатель внутриклеточного образования перекиси водорода; После микроскопического исследования проводится оценка нейтрофилов, содержащих внутриклеточные отложения формазана3.
В нашей лаборатории тест NBT был заменен на Burstest, который использует проточную цитометрию для оценки измененного окислительного метаболизма CGD-нейтрофилов или других состояний и для изучения эффекта иммуномодулирующих препаратов4.
Обучение пациентов – избегайте отбора проб во время острой инфекции4.
Собранный образец – венозная кровь4.
Контейнер для сбора урожая – вакутейнер с гепаринатом лития4.
Объем теста – минимум 10 мл гепаринизированной крови4.
Стабильность образца – кровь должна поступать в лабораторию, где проводится анализ не более 24 часов, и в течение этого периода она хранится при комнатной температуре. Охлаждение образца противопоказано4.
Причины отклонения образца – образцы, которые превысили интервал стабильности, охлажденные или замороженные образцы4.
Метод – проточная цитометрия.
Бурстест позволяет количественно оценить окислительный взрыв в нейтрофилах и моноцитах. Опонизированные бактерии без метки (E.coli) используются в качестве стимулирующих частиц, лиганд протеинкиназы C (PMA – Forbol12-миристат-13-ацетат) в качестве сильного, независимого от рецептора стимула и хемотаксический пептид N-формил-MetLeuPhe (fMLP) в качестве слабого физиологического стимула. , Гепаринизированную кровь пациента инкубируют с упомянутыми раздражителями при 37 ° С; также используется тест с отрицательной контрольной ролью, который не инкубируется со стимулами; после стимуляции нейтрофилы и моноциты продуцируют активные формы кислорода, которые уничтожают бактерии внутри фагосомы; образование этих соединений контролируют путем добавления флуорогенного субстрата – дигидрородамина (DHR), который после окисления будет генерировать флуоресцентные внутриклеточные продукты, обнаруженные позднее методом проточной цитометрии; реакцию останавливают, добавляя раствор для лизиса, который удаляет эритроциты и вызывает частичную фиксацию лейкоцитов; окрашивающий раствор ДНК, добавляемый перед анализом методом проточной цитометрии, исключает артефакты, генерируемые бактериальными агрегатами, которые обладают лейкоцитоподобными светорассеивающими свойствами; используется аргоновый лазер (488 нм, синий свет); для каждого образца 10 000 000 000 лейкоцитов собирают путем стробирования; анализируются как процент клеток (нейтрофилов и моноцитов), которые продуцировали активные формы кислорода (рекрутинг), так и средняя интенсивность их флуоресценции (активность, количество расщепленного субстрата); с этой целью будет проведено «стробирование» соответствующей группы лейкоцитов и проанализирована гистограмма зеленой флуоресценции (FL1); при использовании отрицательного контроля маркер флуоресценции-1 (FL1) будет установлен таким образом, чтобы менее 1% событий были положительными; процент клеток, которые продуцируют активные формы кислорода, может быть затем определен путем подсчета событий, расположенных над маркером; средняя интенсивность флуоресценции коррелирует с количеством продуктов, генерируемых одним лейкоцитом4.
Справочные значения и передача результатов
Сообщаются следующие параметры:
Процент нейтрофилов, продуцирующих активные формы кислорода:> 84%
Нейтрофильная окислительная активность:> 550 мФИ
mfi = средняя интенсивность флуоресценции4.
ограничение
Образцы с количеством лейкоцитов вне контрольного диапазона требуют коррекции количества добавленных бактерий4.
Список используемой литературы
1. Анатолий Панасюк, Иоланта Высока, Эльзбета Мачёрковская, Божена Панасюк, Данута Прокопович, Януш Зак, Кароль Радомски. Фагоцитарная и окислительная взрывная активность нейтрофилов в конечной стадии цирроза печени. В Мировом Журнале Гастроэнтерологии 2005; 11 (48): 7661-7665.
2. Франческо Дати и Эрвин Метцманн. Иммунодефициты: характеристики и результаты лабораторных исследований. Лаборатория испытаний и клинического использования белков, Media Print Taunusdruck GmbH, Франкфурт-на-Майне; 2005,187.
3. Кимберли В. Сэнфорд, Сьюзен Д. Розефф. Расстройства иммунодефицита. В «Клинической диагностике и ведении Генри лабораторными методами», Saunders-Elsevier, 21-е издание, 911.
4. Синевская лаборатория. Конкретные ссылки на используемые технологии работы 2011 года. Тип ссылки: Каталог.
5. Роджер С. Райли, Джонатан Бен-Эзра. Лабораторная оценка клеточной иммунной системы. В «Клинической диагностике и ведении Генри лабораторными методами», Сондерс-Эльзевир, 21-е издание, 826-830

SKU: IM256 Durata 10 zile sânge venos

Informaţii generale şi recomandări pentru efectuarea testului

Neutrofilele deţin un rol important în răspunsul imun nespecific, în special în rezistenţa antibacteriană, ca celule efectoare, inductoare şi reglatoare. Printre caracteristicile lor esenţiale se numără:

• marginaţia şi aderarea la celulele endoteliului vascular;
• traversarea peretelui vascular (diapedeza) şi migrarea către focarele de inflamaţie;
• recunoasterea şi fagocitarea moleculelor opsonizate;
• degradarea şi distrugerea acestor molecule prin generarea de radicali toxici de oxigen.

Aceste caracteristici sunt facilitate de prezenţa de receptori aflaţi la suprafaţa şi în interiorul celulelor, cum ar fi receptorii pentru citokine, neuromediatori, autacoizi şi hormoni.

Chemotactismul neutrofilelor se produce ca răspuns la factorii chemotactici (chemotaxine) generaţi la nivelul focarului lezional. Mai mult, chemotaxinele intensifică metabolismul neutrofilelor, agregarea acestora şi acţiunile bactericide.

Fagocitoza este mediată de opsonine circulante, specifice (imunoglobuline IgG) sau nespecifice (componente ale complementului), neutrofilele având receptori pentru fragmentul Fc al imunoglobulinelor IgG1, IgG2 şi pentru fragmentul complementului iC3b (C3b inactivat). Microorganismele absorbite şi opsonizate sunt distruse atât prin mecanisme oxigen-dependente cât şi oxigen-independente. Radicalii liberi de oxigen degradează bacteriile absorbite în fagozomi şi sunt parţial eliberaţi în mediul înconjurător unde intensifică distrugerea microorganismelor şi determină simultan lezarea ţesuturilor. Procesul este caracteristic inflamaţiei acute, fiind mult mai rar întâlnit în afecţiunile inflamatorii cronice. Distrugerea microorganismelor se mai poate produce şi prin intermediul proteinelor prezente în granulaţiile azurofiele cum ar fi: catepsina G, lizozimul, interferonii etc.

Mediatorii inflamaţiei, citokinele (de exemplu, TNFα) şi selectinele cresc abilitatea granulocitelor de a se localiza la nivelul focarului de inflamaţie. Capacitatea de fagocitoză este crescută prin intensificarea producţiei de radicali de oxigen şi prin eliberarea enzimelor lizozomale. TNFα este un factor important care potenţează activitatea fagocitară şi citotoxică a neutrofilelor. La rândul lor, granulocitele activate secretă citokine; IL-1 care stimulează producţia de IL-8 de către monocite, celule endoteliale şi fibroblaşti, creşte expresia moleculelor de adeziune CD11b/CD18 şi generarea de radicali de oxigen. Interferonul gamma este o citokină puternică care intensifică expresia receptorului Fc, stimulează modificările oxigenului precum şi eliberarea granulelor din neutrofile1.

Datorită caracteristicilor menţionate granulocitele sunt implicate în răspunsul inflamator precoce, iar anomaliile funcţionale ale acestora, survenite în oricare din etape, determină deficienţe semnificative ale  imunităţii celulare5.

O activitate redusă sau absenţa de generare a exploziei oxidative în neutrofile sau monocite este întâlnită în unele defecte moştenite cum ar fi boala granulomatoasă cronică (CGD). CGD reprezintă un grup heterogen de afecţiuni cu transmitere X-linkată sau autozomal recesivă având la bază mutaţii genetice multiple. Ca urmare a acestor anomalii este afectată una din cele patru subunităţi ale enzimei NADPH oxidază ce catalizează formarea peroxidului de hidrogen. Procesul de fagocitoză se desfaşoară normal însă este perturbat metabolismul oxidativ – oxigenul molecular nu mai este redus la anionul superoxid şi la alţi radicali liberi (radical hidroxil şi peroxid de hidrogen) ce reprezintă componente importante ale mecanismului intracelular de distrugere a bacteriilor.

Pacienţii cu CGD prezintă infecţii recurente cu microorganisme producătoare de catalază, cum ar fi Staphylococcus aureus, care sunt capabili să distrugă peroxidul de oxigen generat de neutrofile. Aceste microorganisme supravieţuiesc ingestiei intracelulare, se multiplică şi determină o reacţie granulomatoasă din partea ţesuturilor, care atunci când devine excesivă poate obstrucţiona tracturile gastrointestinal şi genitourinar. Alte organe ce pot fi afectate de granuloame sunt plămânul, ganglionii limfatici, ficatul, osul. Infecţiile cronice cu Serratia spp., Klebsiella spp., Burkholderia cepacia şi Aspergillus spp., sunt în special problematice. De menţionat că pacienţii cu CGD nu suferă infecţii cu microorganisme catalazo-negative. Debutul bolii are loc de obicei în primii doi ani de viaţă2;3;4.

Explozia oxidativă a neutrofilelor poate fi afectată şi la pacienţii cu transplant precum şi la cei cu SIDA.

Anumite imunomodulatoare (citokine: GM-CSF, G-CSF, TNFα) pot avea un oarecare efect şi asupra metabolismului oxidativ celular4.

Caracteristica principală a neutrofilelor în CGD este aceea că după stimulare nu sunt capabile să producă o explozie oxidativă semnificativă. Metoda clasică pentru screening-ul acestei afecţiuni utilizează un colorant – albastru-nitrat de tetrazol (nitroblue tetrazolium – NTB test) ce este incubat împreună cu neutrofilele stimulate ale pacientului; neutrofilele funcţionale fagocitează, reduc şi precipită colorantul NTB galben rezultând depozite intracelulare de formazan negru-albastrui; aceste depozite reprezintă un indicator al formării intracelulare de peroxid de hidrogen; în urma examinării microscopice se efectuează un scor al neutrofilelor ce conţin depozite intracelulare de formazan3.

În laboratorul nostru testul NBT a fost înlocuit de Bursttest care foloseşte citometria în flux pentru a evalua metabolismul oxidativ alterat al neutrofilelor din CGD sau alte afecţiuni şi pentru a studia efectul unor medicamente imunomodulatoare4.

Pregătire pacient – se va evita recoltarea probei în cursul unei infecţii acute4.

Specimen recoltat – sânge venos4. 

Recipient de recoltare – vacutainer cu heparinat de litiu4.

Volum probă – minim 10 mL sange heparinat4.

Stabilitate probă – sângele trebuie să ajungă în maxim 24 ore la laboratorul la care se efectuează testul şi în această perioadă se păstrează la temperatura camerei. Este contraindicată refrigerarea probei4.

Cauze de respingere a probei – specimene care au depăşit intervalul de stabilitate, probe refrigerate sau congelate4.

Metodă citometrie în flux.

Bursttest permite evaluarea cantitativă a exploziei oxidative din neutrofile şi monocite. Se utilizează bacterii (E. coli) opsonizate nemarcate ca particule stimulante, ligandul de proteinkinaza C (PMA – forbol12-miristat 13-acetat) ca stimul puternic, independent de receptori şi peptidul chemotactic N-formil-MetLeuPhe (fMLP) ca stimul fiziologic slab. Sângele heparinat al pacientului este incubat cu stimulii menţionaţi la 37°C; se utilizează şi o probă cu rol de control negativ care nu este incubată cu stimuli; după stimulare, neutrofilele şi monocitele produc specii reactive de oxigen care distrug bacteriile din interiorul fagozomului; formarea acestor compuşi este monitorizată prin adăugarea unui substrat fluorogenic – dihidrorodamina (DHR) – care odată oxidat va genera produşi intracelulari fluorescenţi detectaţi ulterior prin citometrie în flux; reacţia este stopată prin adăugarea soluţiei de liză ce îndepărtează eritrocitele şi determină o fixare parţială a leucocitelor; soluţia de colorare a ADN-ului, adăugată înaintea analizei prin citometrie în flux, exclude artefactele generate de agregatele bacteriene care au proprietăţi de dispersare a luminii asemănătoare leucocitelor; se utilizează un laser cu argon (488 nm, lumina albastră); pentru fiecare probă se colectează prin “gating” 10000-15000 leucocite; sunt analizate atât procentul de celule (neutrofile si monocite) care au produs specii reactive de oxigen (recrutare), cât şi intensitatea medie a fluorescenţei acestora (activitatea, cantitatea de substrat clivat); în acest scop se va efectua un “gating” pe grupul leucocitar relevant şi se va analiza histograma fluorescenţei verzi a acestuia (FL1); prin utilizarea controlului negativ se va seta un marker pentru fluorescenţa-1 (FL1) astfel încât sub 1% din evenimente să fie pozitive; procentul de celule care produc specii reactive de oxigen va putea fi apoi determinat prin numărarea evenimentelor localizate deasupra marker-ului; intensitatea medie a fluorescenţei se corelează cu numărul de produşi generaţi de către un singur leucocit4.

Valori de referinţă şi comunicarea rezultatelor

Sunt raportaţi următorii parametri:

  • procentul de neutrofile care produce specii reactive de oxigen: >84%
  • activitate oxidativă de neutrofile: >550 mfi; mfi = intenistatea medie a fluorescenţei4
Limite şi interferenţe
Probele cu un număr de leucocite aflat în afara intervalului de referinţă necesită o corecţie a cantităţii de bacterii adăugate4.

 

Bibliografie

1. Anatol Panasiuk, Jolanta Wysoka, Elzbieta Maciorkowska, Bozena Panasiuk, Danuta Prokopowicz, Janusz Zak, Karol Radomski. Phagocytic and oxidative burst activity of neutrophils in the end stage of liver cirrhosis. In World Journal of Gastroenterology 2005; 11(48):7661-7665.
2. Francesco Dati & Erwin Metzmann. Immunodeficiencies: Characteristics and laboratory findings. In Proteins Laboratory Testing and Clinical Use, Media Print Taunusdruck GmbH, Frankfurt am Main; 2005,187.
3. Kimberley W. Sanford, Susan D. Roseff. Immunodeficiency Disorders. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Saunders-Elsevier, 21st Edition, 911.
4. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2011. Ref Type: Catalog.
5. Roger S. Riley, Jonathan Ben-Ezra. Laboratory Evaluation of the Cellular Immune System. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Saunders-Elsevier, 21st Edition, 826-830.
< inapoi la lista

Pret 1260.00 MDL