Комплекс -ДНК микобактерий туберкулеза

Род Mycobacterium принадлежит к семейству Mycobacteriaceae. Бактерии этого рода представляют собой неинкапсулированные, не спорулированные бациллы, обязательно аэробные, неподвижные, устойчивые к кислоте и алкоголю (выделено окрашиванием по Цилю-Нильсену) с медленным ростом (среда Лоуэнштейна-Йенсена).
По оценкам Всемирной организации здравоохранения, ежегодно Mycobacterium tuberculosis является причиной почти 2 миллионов смертей и 9 миллионов вновь диагностированных случаев туберкулеза во всем мире.
Человек является единственным резервуаром для M. tuberculosis, источником инфекции которого являются пациенты, которые удаляют бациллы с помощью дыхательных путей (выделение легких), почек (выделение почек) или абсцесса ганглиев (выделение лимфатических узлов). Существуют также выделители кожи, например, с туберкулезом костей.
Наиболее распространенной клинической формой является туберкулез легких, но это состояние может иметь много других внелегочных локализаций (в ~ 10% случаев): костно-суставный, лимфатический узел, мочеполовой, кишечный, менингеальный6; 9.
Туберкулез легких
Обычные лабораторные тесты, используемые для выявления инфекции, - это микроскопическое исследование кислотоустойчивых бацилл (окрашивание по Цилю-Нильсену, флуоресцентное окрашивание) и микобактериальная культура (стандартный метод диагностики). Хотя быстрое и недорогое микроскопическое исследование имеет ограниченную ценность из-за его низкой чувствительности (50–70%) и низкой положительной прогностической ценности в регионах, где распространена нетуберкулезная микобактерия (50–80%). Культура окончательно устанавливает диагноз туберкулеза, но из-за медленной скорости роста микобактерий, результаты доступны в среднем через 4-6 недель. В результате разработки методов амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР) и их внедрения в современную медицинскую практику улучшилось ведение пациентов с подозрением на туберкулез: раннее начало лечения, улучшение клинического состояния, создание более широких возможностей для прекращения передачи инфекции и более эффективных мер общественного здравоохранения. В Соединенных Штатах CDC (Центр по контролю и профилактике заболеваний) недавно разработал руководство по использованию тестов амплификации нуклеиновых кислот для диагностики туберкулеза легких. Таким образом, CDC рекомендует проводить ПЦР-тест по крайней мере в тесте дыхательной секреции у всех пациентов с признаками и симптомами туберкулеза легких (кашель, который сохраняется в течение> 3 недель без очевидной причины, рентгенологические поражения, совместимые с туберкулезом), в тех подозревается на туберкулез, но без подтвержденного диагноза или в ситуациях, когда результат теста может изменить ведение случая или контактный контроль
Основная информация
Род Mycobacterium принадлежит к семейству Mycobacteriaceae. Бактерии этого рода представляют собой неинкапсулированные, не спорулированные бациллы, обязательно аэробные, неподвижные, устойчивые к кислоте и алкоголю (выделено окрашиванием по Цилю-Нильсену) с медленным ростом (среда Лоуэнштейна-Йенсена).
По оценкам Всемирной организации здравоохранения, ежегодно Mycobacterium tuberculosis является причиной почти 2 миллионов смертей и 9 миллионов вновь диагностированных случаев туберкулеза во всем мире.
Человек является единственным резервуаром для M. tuberculosis, источником инфекции которого являются пациенты, которые удаляют бациллы с помощью дыхательных путей (выделение легких), почек (выделение почек) или абсцесса ганглиев (выделение лимфатических узлов). Существуют также выделители кожи, например, с туберкулезом костей.
Наиболее распространенной клинической формой является туберкулез легких, но это состояние может иметь много других внелегочных локализаций (в ~ 10% случаев): костно-суставный, лимфатический узел, мочеполовой, кишечный, менингеальный6; 9.
Туберкулез легких
Обычные лабораторные тесты, используемые для выявления инфекции, - это микроскопическое исследование кислотоустойчивых бацилл (окрашивание по Цилю-Нильсену, флуоресцентное окрашивание) и микобактериальная культура (стандартный метод диагностики). Хотя быстрое и недорогое микроскопическое исследование имеет ограниченную ценность из-за его низкой чувствительности (50–70%) и низкой положительной прогностической ценности в регионах, где распространена нетуберкулезная микобактерия (50–80%). Культура окончательно устанавливает диагноз туберкулеза, но из-за медленной скорости роста микобактерий, результаты доступны в среднем через 4-6 недель. В результате разработки методов амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР) и их внедрения в современную медицинскую практику улучшилось ведение пациентов с подозрением на туберкулез: раннее начало лечения, улучшение клинического состояния, создание более широких возможностей для прекращения передачи инфекции и более эффективных мер общественного здравоохранения. В Соединенных Штатах CDC (Центр по контролю и профилактике заболеваний) недавно разработал руководство по использованию тестов амплификации нуклеиновых кислот для диагностики туберкулеза легких. Таким образом, CDC рекомендует проводить ПЦР-тест по крайней мере в тесте дыхательной секреции у всех пациентов с признаками и симптомами туберкулеза легких (кашель, который сохраняется в течение> 3 недель без очевидной причины, рентгенологические поражения, совместимые с туберкулезом), в тех подозревается на туберкулез, но без подтвержденного диагноза или в ситуациях, когда результат теста может изменить ведение случая или контактный контроль
Туберкулез мочеполовой системы проявляется в виде повторной инфекции мочевыводящих путей, которая не реагирует на обычные антибиотики. Симптомы, как правило, прерывистые и неспецифические, наиболее распространенными проявлениями являются: полиурия (вначале в течение дня, позднее ночью), дизурия, надлобковая боль, гематурия, пиурия и лихорадка.
Диагностическим критерием туберкулеза мочеполовой системы является выделение микобактерий туберкулеза из мочи. Это нелегко сделать, потому что выделение бацилл в мочу носит спорадический характер и, что более важно, количество мочевых бактерий невелико. Культура является наиболее чувствительным методом, но это занимает 6-8 недель, из-за медленной скорости роста микобактерий. Таким образом, наиболее распространенным методом в паукибациллярных ситуациях является ПЦР, присутствие крайне небольшого количества бактерий можно обнаружить в течение 24-48 часов. Высокая чувствительность ПЦР делает этот метод точным для обнаружения ДНК бактерий из комплекса Mycobacterium tuberculosis в образцах мочи8.
Туберкулезный менингит трудно диагностировать; неврологические симптомы устанавливаются коварно, на фоне бактериальной пропитки. Начало длительное, с лихорадкой или низкой температурой, рвотой, светобоязнью, головной болью и головокружением. В течение этого периода синдром менингеального раздражения, который может быть неполным или слабо выраженным, добавляет признаки повреждения глазодвигательных нервов (опущение век, косоглазие и т. Д.).
У иммунокомпетентных людей Mycobacterium tuberculosis вызывает острую или подострую форму заболевания, для которой характерны лихорадка, головная боль, сонливость, менингизм и спутанность сознания, которая длится около 2-3 недель.
Диагноз туберкулезного менингита устанавливается после выделения бацилл в спинномозговой жидкости. Быстрый и надежный диагноз этого состояния может быть установлен с помощью ПЦР, хотя ложноотрицательные результаты могут наблюдаться в образцах, содержащих очень мало микроорганизмов.
Туберкулезный плеврит встречается примерно у 30% больных туберкулезом. Повреждение плевры может быть первичным, вторичным по отношению к туберкулезу легких или вызванным реактивацией инфекции в контексте иммуносупрессии. Туберкулезные бациллы редко можно увидеть на окрашенных препаратах Циля-Нильсена или выделенных в культуре, потому что плевральный выпот при туберкулезе развивается в результате иммунологических механизмов (реакция гиперчувствительности замедленного типа на белки микобактерий). Определение аденозин-деаминазы (ADA) в плевральной жидкости также имеет пониженную чувствительность и специфичность. В исследовании, опубликованном в 2001 году, было установлено, что ПЦР-тест в плевральной жидкости имеет чувствительность и специфичность 70% и 100% соответственно;
Перитонеальный туберкулез является необычным проявлением внелегочной инфекции Mycobacterium tuberculosis. Пациенты с циррозом, ВИЧ-инфекцией, диабетом, новообразованиями, лечением биологическими агентами (анти-TNF-альфа), а также пациентами с постоянным амбулаторным перитонеальным диализом (CAPD) подвергаются повышенному риску. Инфекция чаще всего возникает в результате реактивации скрытых туберкулезных очагов в брюшине, возникающих в результате гематогенной диссеминации из первичного легочного очага. В редких случаях микобактерии попадают в трансмуральную брюшную полость в случае инфекции тонкой кишки или прилегают в случае туберкулезного сальпингита. Более 90% пациентов с туберкулезным перитонитом на момент постановки диагноза имели асцит (механизм асцита аналогичен таковому при плевральном карциноматозе); небольшое количество ассоциируют с «сухой» фиброзной формой. Поскольку смертность при перитоните туберкулеза высока, молекулярные тесты могут быстро установить диагноз4; 9.
Перикардит туберкулеза является наиболее распространенной причиной перикардита в Африке и других странах, где туберкулез является серьезной проблемой здравоохранения и где распространенность ВИЧ-инфекции также высока. В развитых странах заболеваемость туберкулезным перикардитом значительно ниже (всего 4% от всего перикардита). Повреждение перикарда обычно происходит через ретроградную лимфатическую диссеминацию из перитрахеальных, перибронических или средостенных лимфатических узлов или через гематогенную диссеминацию из первичного очага. Смежное распространение от травмы легкого встречается редко. Иммунный ответ на жизнеспособные кислото-устойчивые бациллы, попадающие в перикард, ответственен за заболеваемость, связанную с туберкулезным перикардитом. Бактериальные белковые антигены индуцируют реакцию гиперчувствительности замедленного типа, характеризующуюся выделением лимфокинов стимулированными лимфоцитами, которые активируют макрофаги и влияют на образование гранулем. Описаны 4 стадии эволюции туберкулезного перикардита: экссудативно-фибринозный с образованием ранней гранулемы; серозный кровотечение; резорбция выпота с организацией гранулематозной казеизации и утолщения перикарда, вызванного фибрином, коллагенозом и, наконец, фиброзом; рубцов, что в конечном итоге приводит к развитию констриктивного перикардита. С клинической точки зрения туберкулезный перикардит может проявляться в 3 формах: выпот в перикарде, который может осложняться в 10% случаев с тампонадой перикарда, сужением перикардита и сочетанием выделения жидкости с сужением. Определение ДНК комплекса Mycobacterium tuberculosis в перикардиальной жидкости является быстрым методом установления диагноза и раннего начала туберкулостатической терапии2.
Костно-суставной туберкулез является причиной примерно 10% случаев внелегочного туберкулеза. Наиболее распространенными локализациями инфекции являются: позвонки (50%), тазобедренный сустав (15%) и коленный сустав (15%). Повреждения костей и деформации являются поздним признаком туберкулеза. ПЦР-анализ синовиальной жидкости является быстрым методом диагностики артрита коленного сустава7.
Рекомендации по определению микобактерий туберкулеза - ДНК
-Быстрое обнаружение комплекса ДНК Mycobacterium tuberculosis в различных патологических продуктах.
-Диагностика туберкулеза в связи с выделением М. tuberculosis в культуре
Pregatire pacient – nu este necesara5.
Specimen recoltat – a) probe recoltate din tractul respirator: sputa, lichid obtinut prin spalatura bronsica sau lavaj bronho-alveolar; b) o proba de urina spontana; c) lichid cefalorahidian recoltat prin punctie lombara; d) lichid de punctie (pleural, pericardic, ascita, sinovial)5.
Recipient de recoltare – eprubeta pentru urina; recipient steril pentru restul probelor5.
Cantitate recoltata– a) 3 mL; b) 5 mL; c) si d) minimum 2 mL5.
Prelucrare necesara dupa recoltare– probele nu vor fi centrifugate5.
Stabilitate proba– probele sunt stabile 48 orela 2-4°C inainte de extractia acizilor nucleici5.
Metoda – Real-time PCR TaqMan: reactie de polimerizare in lant cu detectie in timp real a produsului PCR acumulat, prin masurarea fluorescentei emise (test calitativ)5.
Valori de referinta– Mycobacterium tuberculosis complex – ADN nedetectabil5.
Limita de detectie – 20 copii/proba5.
Interpretarea rezultatelor
Un rezultat pozitiv indica prezenta ADN-ului Mycobacterium tuberculosis in proba testata5;6.
Rezultatele obtinute in cazul probelor recoltate din tractul respirator vor fi interpretate impreuna cu cele furnizate de examenul microscopic, astfel:
● Examen microscopic pozitiv si test PCR pozitiv: se va considera ca pacientul are tuberculoza si se va incepe tratamentul specific; vor fi asteptate oricum rezultatele la cultura pentru confirmarea definitiva a diagnosticului.
● Отрицательное микроскопическое исследование и положительный ПЦР-тест: в зависимости от клинического контекста и других исследований, врач решит начать туберкулостатическую терапию; при необходимости, тест ПЦР будет повторен на новом образце; результаты в культуре будут ожидаемы в любом случае для окончательного установления диагноза.
● Позитивное микроскопическое исследование и отрицательный ПЦР-тест: если ПЦР-тест был подтвержден правильно (внутренний контроль в допустимых пределах) и 2 отрицательных результата были получены на 2 разных образцах, можно предположить, что у пациента есть инфекция нетуберкулезными микобактериями; клиницист решит начать специфическую терапию в особых случаях, когда клиническое подозрение на туберкулез велико, даже если тест ПЦР дал отрицательные результаты; результаты в культуре будут ожидаемы в любом случае для окончательного установления диагноза.
● Отрицательное микроскопическое исследование и отрицательный ПЦР-тест: невозможно полностью исключить диагноз туберкулеза; клиницист решит начать специфическую терапию в особых случаях, когда клиническое подозрение на туберкулез велико, даже если микроскопическое исследование и тест ПЦР дали отрицательные результаты; результаты в культуре будут ожидаемы в любом случае для окончательного установления диагноза
Пределы и помехи
Также возможны ситуации, в которых валидация теста ПЦР не получена (внутренний контроль не находится в допустимых пределах); это может указывать на наличие ингибиторов в тестируемых продуктах (3-7% случаев), которые препятствуют амплификации ДНК. В этом случае тест ПЦР не может быть использован для выяснения диагноза3.
Этот тест должен быть выполнен вместе с бактериальными культурами.
Для правильного диагноза результаты тестов ПЦР должны быть соотнесены с клиническими симптомами, присутствовавшими на момент исследования.
Отрицательный результат не исключает наличия Mycobacterium tuberculosis, поскольку бацилла может присутствовать на уровнях ниже предела обнаружения этого теста.
Эффективность теста ПЦР не оценивалась у пациентов, у которых уже началось лечение туберкулеза
Список используемой литературы
1. Бабу С. Нагеш, Шобха Сегал, Суриндер К. Джиндал и Сунил К. Арора. Оценка полимеразной цепной реакции для выявления микобактерий туберкулеза в плевральной жидкости. В сундуке 2001; 119; 1737-1741 гг.
2. Бонги М. Майози. Туберкулезный перикардит. В обращении. 2005; 112: 3608-3616.
3. CDC. Обновленное Руководство по использованию тестов на амплификацию нуклеиновых кислот в диагностике туберкулеза, MMVR, январь. 2009, 58 (01), 7-10.
4. Чау К.М. Чау ВК; Повесить ЛНР; Вонг СМ; Szeto CC. Смертность, связанная с туберкулезным перитонитом, высока среди пациентов, ожидающих результатов микобактериальных культур образцов асцитной жидкости. In Clin Infect Dis 2002 Aug 15; 35 (4): 409-13. Epub 2002 17 июля.
5. Синевская лаборатория. Конкретные ссылки на рабочую технологию, использованную в 2010 году. Тип ссылки: Каталог.
6. Клиника Майо. Медицинские лаборатории Майо. Каталог тестов: Mycobacterium tuberculosis Complex, молекулярная диагностика, ПЦР. www.mayomedicallaboratories.com. Тип ссылки: Интернет-связь.
7. Нобуказу Фудзимото и соавт. Туберкулез диагностируется с помощью ПЦР-анализа синовиальной жидкости. В Журнале инфекции и химиотерапии, том 16. № 1, февраль 2010, 53-55.