Гемофилия А - исследование инверсий IVS1 и IVS2

Общая информация

Гемофилия А (классическая гемофилия), вызванная дефицитом коагулянтной активности FVIII, представляет собой, как часто, второе наследственное геморрагическое заболевание после болезни фон Виллебранда с частотой до 1/10000 человек с аналогичной распространенностью среди различных расовых групп1;2. Гемофилия А является классическим примером рецессивной страны X-linkata, причем заболевание вызвано гетерогенными мутациями в гене fVIII (F8) на хромосоме Xp286.

Заболевание проявляется у мужчин, у которых нет нормального аллеля; они не передают аномалию своим сыновьям, но все дочери являются носителями тары. Большинство женщин-носителей не страдают из-за наличия унаследованного нормального аллеля от матери, и они передадут болезнь половине своих сыновей и статусу перевозчика половине дочерей.2.

Пациенты с данным заболеванием демонстрируют переменный фенотип в зависимости от тяжести дефицита FVIII и экспрессивности генетического дефекта соответственно, но в тех же семьях клиническая тяжесть постоянна,хотя другие генетические или экологические факторы могут в определенной степени изменять клиническую серьезность 1;2. Таким образом, пациенты с тяжелой гемофилией а (уровень FVIII <1%) диагностируются в течение первого года жизни, при глубоких мышечных кровотечениях и спонтанных гемартрозах проявляются наиболее распространенные симптомы. Люди с умеренно тяжелой гемофилией А (FVIII = 2-5%) обычно испытывают длительное или отсроченное кровотечение после незначительной травмы и обычно диагностируются в возрасте до 5-6 лет. Люди с легкой гемофилией A (FVIII = 5-30%) испытывают аномальное кровотечение после операции, удаления зубов или серьезной травмы, обычно они диагностируются позже в течение жизни 1;5. Доля тяжелых, умеренных, легких случаев составляет 50%, 10% и 40% 6 соответственно. Около 10% женщин-носителей имеют уровень FVIII <35% и имеют симптомы, симптомы обычно легкие, причем различия в уровне FVIII приписываются лионизации (инактивация нормальной Х-хромосомы в ходе эмбриогенеза)1;5;6. Другими причинами гемофилии А у женщин являются: ребенок женского пола наследует две аномальные Х-хромосомы от своего гемофильного отца и матери-носителя; некоторые хромосомные заболевания могут привести к появлению гемизиготного генотипа и вызвать гемофилию из-за отсутствия нормального аллеля: мозаицизм 45XX/45X, кариотип 46xy, делеция Х-хромосомы (генотип XO, синдром Тернера). В редких случаях неземофильные заболевания, с аутоиммунными заболеваниями (системная красная волчанка, ревматоидный артрит) или после приема лекарств (пенициллины, фенитоины) или с лимфопролиферативными заболеваниями, могут развиться аутоантитела против FVIII, которые вызывают гемофилию приобретенный.

Сопутствующая мутация фактора V Лейдена или других протромботических факторов риска может объяснить изменчивость фенотипа между пациентами с одним и тем же молекулярным дефектом FVIII2.

Розендаль и другие (1990) представили доказательства того, что смертность от ишемической болезни сердца у гемофилов ниже, чем у населения в целом 6.

Ген FVIII имеет 186 п. н. (пар оснований) с 26 экзонами и 25 интронами, содержащими CpG-островки, которые предрасполагают ген к мутациям и кодируют мРНК размером 9 т. п. н., при этом около 5% ДНК локализуется в экзонах, А 95% представляют “некодирующую” ДНК. FVIII экспрессируется сигнальным пептидом из 19 аминокислот, зрелый белок имеет 2332 остатка, причем структура доменов в аминоконцевом конце представляет собой “A1-A2-B-A3-C1-C2”, гомолог FV коагуляции. Он в основном синтезируется в печени и циркулирует в плазме в инактивированной форме, стабилизируемой связыванием FVW. После активации тромбином он высвобождается FVW и связывается с фосфолипидной мембранной поверхностью.

Диагноз гемофилии А устанавливается у лиц с низким уровнем коагулянтной активности FVIII при наличии нормального уровня FVW1;4.

Рекомендации по генетическому тестированию при гемофилии А1; 5

Генетическое тестирование пострадавшего человека для выявления специфической мутации FVIII в семье с целью получения информации, необходимой для генетического консультирования членов семьи с высоким риском.

Дифференциальная диагностика с болезнью фон Виллебранда, особенно типа 3 (который клинически и биохимически похож на легкую гемофилию), константа в генетическом тестировании гена FVIII, генетическом тестировании гена FVW или измерении активности fVIII-связывающего FVW (когда это доступно).

У людей, представляющих единственный случай в семье, идентификация конкретной мутации может помочь предсказать клинический фенотип и установить риск развития ингибиторов FVIII.

Тестирование на carrier родственников из группы риска (требует выявления причинной мутации в семье). Рекомендуется установить статус перевозчика до беременности или как можно раньше во время беременности.

Пренатальная и предимплантационная диагностика беременностей, подверженных риску (требует выявления причинной мутации в семье). Обычная процедура состоит из определения пола плода путем анализа хромосом в клетках плода, полученных из ворсинок хориуса через 10-12 недель беременности или амниоцентеза через 15-18 недель, и если кариоптип 46XY, ДНК, извлеченная из клеток плода, может быть проанализирована на наличие мутации или для информационных маркеров. Если мутация неизвестна, а связь не информативна, пренатальная диагностика возможна путем измерения свертывающей активности FVIII в крови, полученной путем чрескожной пункции пуповины на 18-21 неделе беременности (риск смерти плода 1-6%).

Собранный образец-венозная кровь 3.

Контейнер для сбора-vacutainer, содержащий ЭДТА в качестве антикоагулянта3.

Собранное количество-насколько позволяет вакуум3.

Причины отторжения образца-использование гепарина в качестве антикоагулянта 3.

Стабильность образца - 7 дней при 2-8ºC3.

Метод-доступны два варианта тестирования:

- анализ инверсий IVS1 и IVS22 с помощью реакции полимеризации цепи (ПЦР) впервые рекомендован пациентам с тяжелой гемофилией А;

- расширенная панель гемофилии a: секвенирование гена F8 и анализ делетий/дупликаций с помощью MLPA у пациентов с тяжелой гемофилией A, у которых не обнаруживается ни одна из двух инверсий, а также у пациентов с легкой или умеренной гемофилией A1,3.

Интерпретация результатов

Около 98% пациентов с гемофилией А демонстрируют мутации в гене F8, причем сообщается о более чем 1000 мутациях, включая делеции, вставки, точечные мутации Динуклеотидов CpG, которые являются особенно распространенными. Широкие делеции (>50 нуклеотидов) встречаются примерно у 5% пациентов с гемофилией А. около 40% случаев тяжелой гемофилии А возникают в результате большой инверсии вершины длинной руки Х-хромосомы, одной из ее точек разрыва (точки разрыва), расположенных на уровне интрона 22. Другая распространенная инверсия на уровне интрона 1 происходит в 2-3% тяжелых нарушений FVIII2;5.

Ген F8A представляет собой ген, расположенный внутри гена FVIII, полностью содержащийся в интроне 22, лишенный интронов и транскрибируемый в обратном направлении по сравнению с FVIII. Х-хромосома содержит 3 копии F8A и прилегающих к ней областей, одну в интроне 22 и две теломеры и ~500 Кб выше по течению от стартового сайта транскрипции FVIII. Интрон 22 необычен во многих отношениях. Это самый большой Интрон гена FVIII (32 Кб), а также содержит локализованный остров CpG ~10 кб ниже экзона 22, который, по-видимому, служит двунаправленным промоутером для F8A и F8B (ген F8B также локализован в интроне 22 и транскрибируется в обратном направлении по сравнению с FVIII). Многие мутации, возникающие в результате тяжелой гемофилии А, основаны на рекомбинации между гомологичными последовательностями F8A в интроне 22 и выше по течению от гена FVIII, что приводит к инверсии и транслокации экзонов 1-22 по сравнению с экзонами 23-26. Этот дефект возникает в основном в мужских половых клетках во время мейотического деления клеток, когда отсутствие двухвалентного образования способствует “изгибу” (“переворачиванию”) теломерного конца одной Х-хромосомы 4,6.

Фактор VIII с инверсией в интроне 1 Х-хромосомы.

Интрон 1, фланкированный экзонами, ориентирован в направлении транскрипции, содержит повторяющуюся последовательность 9b, фланкированную одиночными последовательностями 9a и 9c; после рекомбинации между двумя последовательностями 9b происходит инверсия. CEN-центромерный; тел-теломерный. Ричард Д. Баньялл, Наушин Васим, Питер М. Грин и Франческо Джаннелли, Блад, 2002, 99: 168-174.

Частота обнаружения мутаций у людей с гемофилией А, у которых нет одной из двух общих инверсий, колеблется от 75 до 98%. При тяжелой гемофилии грубых изменений гена (широкие делеции или вставки, мутации рамки считывания или соединения “сплайсинга", бессмысленные и миссенс-мутации) учитываются примерно в 50% обнаруженных мутаций 1.

Вместо этого у пациентов с умеренной или легкой гемофилией A чаще всего обнаруживаются миссенс-точечные мутации на уровне экзонов , кодирующих Домены A или C1;2, причем около половины мутаций сгруппированы на уровне домена A26.

Продукты аномального гена варьируются между отсутствием обнаруживаемого белка (в большинстве случаев тяжелой гемофилии а) при нормальных уровнях дисфункционального белка (5% случаев), при этом остальные пациенты (45%) имеют соответственно низкие уровни антигена и коагулянтную активность FVIII. Определенные мутации, такие как недоношенные концевые кодоны, инверсии или широкие делеции генов, связаны с повышенным риском развития ингибитор1; 6.

Существуют элементы предикторной семейной истории для статуса перевозчика женщины:

• женщина, у которой есть один пострадавший сын, а другой пострадавший родственник по материнской линии является обязательным перевозчиком;
• если у женщины более одного пострадавшего сына, и мутация не может быть обнаружена на уровне ДНК, то она демонстрирует мозаицизм зародышевой линии (редко).

Гемофилия также возникает в результате увеличения частоты спонтанных мутаций, чему способствуют большие размеры генов (186 КБ) и наличие горячих точек (“горячих точек”), таких как динуклеотиды CpG, эти мутации встречаются как минимум в 3 раза чаще у мужчин, чем у женщин. На самом деле около трети гемофилов не имеют семейной истории аномальных кровотечений 2. Если пациент является симплексным случаем (без семейной истории гемофилии) , есть некоторые возможности относительно статуса перевозчика его матери:

- мама не перевозчик, и пациент показывает мутацию de novo;

- мать-это carrier de novo, мутация возникает как мутация зародышевой линии (присутствует во всех клетках и обнаруживается на уровне ДНК), как соматическая мутация (присутствует в некоторых клетках и может не обнаруживаться на уровне ДНК) или мозаицизм зародышевой линии (мутация присутствует в некоторых половых клетках, но не обнаруживается в ДНК в лейкоцитах).;

- мать является носителем и унаследовала причинную мутацию от матери, у которой есть мутация de novo, или от бессимптомного отца, который является мозаикой для мутации;

- мать является носителем мутации, происходящей в предыдущих поколениях, которая проходила через семью, протекая бессимптомно у женщин-носителей.

В целом у матери 80% шансов быть носителем, но вероятность 98%, если у пациента наблюдается тяжелая форма заболевания, связанная с инверсией интрона 221.

Мозаицизм может представлять собой довольно распространенное явление в гемофилии А; таким образом, установление риска в генетическом консультировании должно учитывать возможность соматического мозаицизма в семьях с мутациями, по-видимому de novo, особенно в случае точечных мутаций 5;6.

Они быстро сообщили о случаях гемофилии А с аутосомно-доминантной передачей, которые должны быть дифференцированы по типу 2N от болезни vonWillebrand2.

Границы и помехи

Когда тестирование на carrier проводится без предварительной идентификации мутации в семье, получение отрицательного результата у родственника из группы риска не является информативным.

Измерения коагулянтной активности FVIII недостаточно для определения статуса несущей, это только наводит на мысль, если она низкая 1.

 Библиография

1. Brower C, Thompson A. „Hemophilia A”. GeneReviews, NCBI Bookshelf. Ref Type: Internet Communication.

2. Friedman K, Rodgers G. „Inherited Coagulation Disorders”. In Wintrobe`s Clinical Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 11th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 1379-82.

3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate, 2010. Ref Type: Catalog.

4. Maclean R, Makris M. „Hemophilia A and B”. In Practical Hemostasis and Thrombosis, O’Shaughnessy D, Makris M, Lillicrap D eds, Blackwell Publishing, 2008, 41-43.

5. Mayo Clinic, Mayo Medical Laboratories. Reference Laboratory Services for Health Care Organizations. “Hemophilia A, Molecular Analysis for Inversion, Diagnosis and Carrier Detection”. www.mayomedicallaboratories.com. 2010. Ref Type: Internet Communication.

6. Online Mendelian Inheritance in Man, McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine. „Hemophilia A”. Ref Type: Internet Communication.