Testare genetică (tehnici)
Citogenetică
Principiul metodei
Principiul analizei cromozomilor din lichid amniotic constă în cultivarea amniocitelor fetale pentru obținerea de cromozomi și blocarea diviziunii celulelor în etapa de metafază a mitozei. Cromozomii obținuți sunt bandați și colorați în scopul introducerii unui pattern specific pentru fiecare cromozom în parte și sunt cariotipați cu softul Gen ASIs.
Principiul metodei
Principiul analizei cromozomilor din sânge periferic constă în stimularea proliferării limfocitelor T cu phitohemaglutinină pentru obținerea de cromozomi și blocarea diviziunii celulelor în etapa de metafază a mitozei. Cromozomii obținuți sunt bandați și colorați pentru inducerea unui pattern specific pentru fiecare cromozom în parte și sunt cariotipați.
Cariotip spectral
- detecție microdeleții pe brațul scurt al cromozomuluI Y
- detecție duplicații cromozom 22q11,2
Principiul metodei
Hibridizarea fluorescent în situ (FISH) este o tehnică de citogenetică moleculară utilizată în scopul identificării anomaliilor cromozomiale, numerice și structurale (care nu pot fi determinate prin cariotipare).
Principiul acestei metode constă în atașarea la secvența-țintă a unei sonde de ADN monocatenar (de circa 40kb), marcată fluorescent, pe baza complementarității, de o secvență-țintă a unui cromozom. Hibridizarea sondei cu ADN-ul celular este vizualizată la microscopul cu fluorescent echipat cu filtre de excitație și emisie, ceea ce permite citirea semnalelor zonei țintă.
Sonda pentru gena SRY, marcată cu roșu, este formată din două secvențe care nu se suprapun, 30Kb și 50kb. Secvențele acoperă întreaga genă SRY și AND-ul care o flanchează, inclusiv gena RPS4Y1. Sondele conțin, de asemenea, o sondă de control pentru centromerul cromozomului X(DXZ1) marcat în bleu și pentru cromozomul Y (DYZ1, regiunea heterocromaticăYq12) marcat în verde.
Examinarea preparatelor pe lamă se face cu ajutorul microscopului Zeiss.
Genetica moleculară
Cariotip molecular pentru diagnostic postnatal-array cgh (array-based Comparative Genomic Hybridization)
Principiul metodei
Principiul aCGH se bazează pe compararea cantitativă a ADN-ului testat cu ADN-ul de referință (de obicei aparținând unui individ sănătos). ADN-ul (testat și de refetință) este marcat cu 2 substanțe fluorescente diferite:
- ADN testat – fluorocrom roșu
- ADN referință – fluorocrom verde
Array CGH se lucrează pe scanner Agilent.
Rezultatul cariotipului molecular array CGH descrie, conform ISCN (International System of Human Cytogenetic Nomenclature), modificările numerice și structurale neechilibrate identificate (pierdere sau câștig de material genetic), punctele de ruptură, dimensiunile exacte ale modificărilor.
Real Time PCR
Principiul Metodei
Metoda se bazează pe amplificarea prin PCR multiplex a moleculelor de ADN cu primeri specifici biotinilați, apoi revershibridizarea pe stripuri a acestor produși PCR; aceste stripuri (strips) constau în membrane pe care sunt fixate sonde oligonucleotidice specifice pentru detecția celor 38 de mutații din gena CFTR. Recunoașterea și legarea exactă, pe bază de complementaritate, a produșilor PCR biotinilați la sondele specifice acestora sunt apoi vizualizate colorimetric, cu ajutorul sistemului de colorare biotină-streptavidină conjugată cu fosfataza alcalină și a unui substrat (“developer”) colorat.
Metoda detectează simultan 38 de mutații/variante în gena CFTR, și anume: F508del, I507del, F508C, I502T, 1706del17, 1677del TA, G542X, 1717-1G>A, R553X, Q552X, G551D, S549R A>C, N1303K, 4016insT, R1162X, R1158X, W1282X, G1244E, 2789+5G>A, 2183AA>G, 711+5G>A, 711+1G>T, G85E, 3849+10kbC>T, 621+1G>T, R117H, D1152H, L1065P, R1066H, L1077P, 4382delA, 1259insA, 852del 22, R347P, T338I, S912X, I148T, 3199del6, Allele 5T-7T-9T.
Principiul metodei
ADN genomic izolat din sânge venos este amplificat cu primeri specifici regiunilor de interes AZF prin tehnica PCR multiplex. Analiza fragmentelor fluorescente rezultate este realizată prin electroforeza capilară utilizând analizorul ABI3500.
- Determinare EGFR țesut și plasmă
Principiul Metodei
Test Cobas EGFR are la bază 2 procese majore: prepararea probei și obținerea AND-ului din FFPET (formalin fixed paraffin embedded – țesut fixat în formol și inclus în parafină) și amplificarea prin PCR multiplex a moleculelor de AND cu primeri specifici și sonde oligonucleotidice specific marcate cu fluorochrome (Real-Time PCR).
Această metodă Real-Time PCR detectează simultan 42 de mutații în gena EGFR la nivelul exonilor:
- Exon 18: grupul de mutații (G719X, G719A, GG719C, G719S)
- Exon 19: grupul de deleții
- Exon 20: grupul de mutații (S768I, T790M) și inserții
- Exon 21: grupul de mutații (L858R, L861Q)
