Mycobacterium tuberculosis complex-ADN

Informatii generale

Genul Mycobacterium face parte din familia Mycobacteriaceae. Bacteriile din acest gen sunt bacili necapsulati, nesporulati, obligatoriu aerobi, imobili, acid-alcoolo-rezistenti (se pun in evidenta prin coloratia Ziehl-Neelsen), cu crestere lenta (mediul Lowenstein-Jensen).

Organizatia Mondiala a Sanatatii estimeaza ca in fiecare an Mycobacterium tuberculosis este responsabil de aproape 2 milioane decese si 9 milioane cazuri nou diagnosticate de tuberculoza la nivel mondial.

Omul este singurul rezervor pentru M. tuberculosis, sursa de infectie fiind reprezintata de bolnavii care elimina bacilii pe cale respiratorie (excretori pulmonari), renala (excretori renali) sau prin abcedare ganglionara (excretori ganglionari). Exista si excretori cutanati, cum este cazul bolnavilor de tuberculoza osoasa.

Forma clinica cea mai frecventa este tuberculoza pulmonara, insa aceasta afectiune poate avea multe alte localizari extrapulmonare (in ~10% din cazuri): osteoarticulara, ganglionara, genitourinara, intestinala, meningiana^6;9.

Tuberculoza pulmonara

Testele de laborator conventionale utilizate in depistarea infectiei sunt examenul microscopic pentru evidentierea bacililor acid-alcoolo-rezistenti (coloratia Ziehl-Neelsen, coloratii fluorescente) si cultura mycobacteriilor (metoda standad de diagnostic). Desi rapid si putin costisitor examenul microscopic are o valoare limitata datorita sensibilitatii sale reduse (50-70%) si valorii predictive pozitive scazute in regiunile in care izolarea mycobacteriilor non-tuberculoase este frecventa (50-80%). Cultura stabileste definitiv diagnosticul de tuberculoza, insa datorita ratei lente de crestere a mycobacteriilor rezultatele sunt disponibile in medie dupa 4-6 saptamani. Ca urmare a dezvoltarii tehnicilor de amplificare a acizilor nucleici (PCR) si introducerii acestora in practica medicala curenta s-a imbunatatit management-ul pacientilor suspectati de tuberculoza: initierea precoce a tratamentului, ameliorarea starii clinice, crearea unor posibilitati mai mari de stopare a transmiterii infectiei si a unor interventii de sanatate publica mai eficiente. In SUA, CDC (Center for Disease Control and Prevention) a elaborat recent un ghid de utilizare a testelor de amplificare a acizilor nucleici in diagnosticul tuberculozei pulmonare. Astfel CDC recomanda ca testul PCR sa fie efectuat cel putin intr-o proba de secretie respiratorie la toti pacienti cu semne si simptome de tuberculoza pulmonara (tuse care persista de >3 saptamani fara o cauza evidenta, leziuni radiologice compatibile cu TBC), la cei suspectati de TBC dar fara diagnostic confirmat sau in situatiile in care rezultatul testului ar putea modifica management-ul cazului sau activitatile de supraveghere a contactilor³.

Testul PCR se bazeaza pe amplificarea unei secvente unice a genei katG prezente la membri complexului  Mycobacterium tuberculosis: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium microti. Este posibila astfel detectarea rapida a ADN-ului complexului Mycobacterium tuberculosis  in decurs de 24-48 ore de la sosirea probelor in laboratorul la care se face testarea^5;6. In comparatie cu examenul microscopic valoarea adaugata a testului PCR consta in urmatoarele:

-valoare predictiva pozitiva mare (>95%) la pacientii cu examen microscopic pozitiv care provin din regiuni in care izolarea mycobacteriilor non-tuberculoase este frecventa;

-confirma rapid prezenta Mycobacterium tuberculosis la 50-80% dintre pacientii cu examen microscopic negativ si culturi pozitive.

In comparatie cu izolarea in cultura testele PCR pot detecta prezenta Mycobacterium tuberculosis  cu cateva saptamani mai devreme la  70-90% dintre pacientii suspectati de tuberculoza, al caror diagnostic este confirmat ulterior prin cultura.

Astfel beneficiile testelor PCR sunt evidente: evitarea unui tratament tuberculostatic nenecesar la pacientii cu examen microscopic pozitiv si test PCR negativ, evitarea investigarii si izolarii inutile a contactilor  aceleiasi categorii de  pacienti,  reducerea folosirii inadecvate a fluorochinolonelor ca tratament empiric al pneumoniilor (practica ce a fost incriminata in dezvoltarea rezistentei la fluorochinolone a M. tuberculosis) si a intarzierii initierii tratamentului tuberculostatic la pacientii cu test PCR pozitiv³.

Tuberculoza genito-urinara se manifesta ca o infectie repetata a tractului urinar, care nu raspunde la antibioticele obisnuite. Simptomele sunt in general intermitente si nespecifice, cele mai frecvente manifestari fiind: poliuria (initial in timpul zilei, ulterior noaptea), disuria, durerea suprapubiana, hematuria, piuria si febra.

Criteriul de diagnostic pentru tuberculoza genito-urinara este izolarea Mycobacterium tuberculosis din urina. Acest lucru nu este usor de realizat, deoarece descarcarea bacililor in urina este sporadica si, mai important, numarul bacteriilor urinare este mic. Cultura este cea mai sensibila metoda, dar dureaza 6-8 saptamani, din cauza ratei lente de crestere a mycobacteriilor. De aceea tehnica cea mai folosita in situatiile paucibacilare este PCR-ul, prezenta unui numar extrem de mic de bacterii putand fi astfel detectata in termen de 24-48 ore. Sensibilitate ridicata a PCR face din aceasta metoda una precisa pentru detectarea ADN-ului bacteriilor din complexul Mycobacterium tuberculosis in probele de urina⁸.

Meningita tuberculoasa este dificil de diagnosticat; simptomatologia neurologica se instaleaza insidios, pe fondul impregnatiei bacilare. Debutul este prelungit, cu febra sau subfebrilitati, varsaturi, fotofobie, cefalee si ameteli. In perioada de stare la sindromul de iritatie meningeana, care poate fi incomplet sau slab exprimat, se adauga semne de afectare a nervilor oculomotori (ptoza palpebrala, strabism etc.).

La persoanele imunocompetente Mycobacterium tuberculosis determina o forma acuta sau subacuta de boala caracterizata prin febra, cefalee, somnolenta, meningism si confuzie ce dureaza aproximativ 2-3 saptamani.

Diagnosticul de meningita tuberculoasa se stabileste in urma evidentierii bacilului la nivelul lichidului cefalorahidian. Un diagnostic rapid si fiabil in cazul acestei afectiuni poate fi dat de utilizarea PCR-ului, desi rezultate fals negative ar putea sa apara in probele care contin foarte putine microorganisme^6;9.

Pleurezia TBC apare la aproximativ 30% dintre pacientii cu tuberculoza. Afectarea pleurala poate fi primara, secundara tuberculozei pulmonare sau produsa prin reactivarea infectiei in contextul unei imunosupresii. Bacilii TB sunt rareori vizualizati pe preparatele colorate Ziehl-Neelsen sau izolati in cultura, deoarece revarsatul pleural in tuberculoza se dezvolta ca urmare a unor mecanisme imunologice (reactie de hipersensibilitate de tip intarziat fata de proteinele de Mycobacterium). Determinarea adenozin deaminazei (ADA) in lichidul pleural prezinta de asemenea o sensibilitate si o specificitate redusa. Intr-un studiu publicat in 2001 s-a constatat ca testul PCR din lichidul pleural are o sensibilitate si specificitate de 70% si, respective, 100%^1;9.

Tuberculoza peritoneala este o manifestare neobisnuita a infectiei extrapulmonare cu Mycobacterium tuberculosis. Prezinta un risc crescut pacientii cu ciroza, infectie HIV, diabet zaharat, neoplazii, tratament cu agenti biologici (anti-TNF alfa), precum si cei cu dializa peritoneala ambulatorie continua (CAPD). Infectia se produce cel mai frecvent ca urmare a reactivarii unor focare tuberculoase latente din peritoneu rezultate ca urmare a diseminarii hematogene de la un focar pulmonar primar. Mai rar, mycobacteriile patrund in cavitatea peritoneala transmural in cazul infectiei intestinului subtire sau contiguu in cazul salpingitei TBC. Peste 90% dintre pacientii cu peritonita TBC prezinta ascita  in momentul stabilirii diagnosticului (mecanismul de producere a ascitei este similar celui implicat in carcinomatoza pleurala); un numar redus asociaza o forma fibroadeziva “uscata”. Deoarece mortalitatea este mare in cazul  peritonitei TBC testele moleculare pot stabili rapid diagnosticul^4;9.

Pericardita TBC reprezinta cea mai frecventa cauza de pericardita in Africa si in alte tari in care tuberculoza este o problema majora de sanatate si in care de asemenea prevalenta infectiei HIV este mare. In tarile dezvoltate incidenta pericarditei tuberculoase este mult mai mica (doar 4% din totalul pericarditelor). Afectarea pericardica se produce de obicei prin diseminarea limfatica retrograda de la ganglionii limfatici peritraheali, peribronsici sau mediastinali sau prin diseminare hematogena de la un focar primar. Rareori este implicata o diseminare contigua de la o leziune pulmonara. Raspunsul imun fata de bacilii acid-alcoolo-rezistenti viabili care patrund la nivelul pericardului este responsabil de morbiditatea asociata cu pericardita TBC. Antigenele proteice bacilare induc o reactie de hipersensibilitate de tip intarziat caracterizata prin eliberarea de limfokine de catre limfocitele stimulate, care activeaza macrofagele si influenteaza formarea de granuloame. Se descriu 4 stadii in evolutia pericarditei tuberculoase: exsudativ-fibrinos cu formarea granulomului precoce; de efuziune serosanguina; de resorbtie a efuziunii cu organizarea cazeificarii granulomatoase si ingrosarea pericardului cauzata de fibrina, colagenoza si in final de fibroza; de cicatrizare care are drept consecinta finala dezvoltarea pericarditei constrictive. Din punct de vedere clinic pericardita TBC se poate prezenta sub 3 forme: revarsat pericardic ce se poate complica in 10% din cazuri cu tamponada pericardica, pericardita constrictiva si o combinatie de revarsat lichidian cu constrictie. Determinarea ADN-ului pentru complexul Mycobacterium tuberculosis in lichidul pericardic constituie o metoda rapida de stabilire a diagnosticului si de initiere precoce a terapiei tuberculostatice².

Tuberculoza osteoarticulara este responsabila de aproximativ 10% din cazurile de tuberculoza extrapulmonara. Cele mai frecvente localizari ale infectiei sunt: vertebrele (50%), articulatia soldului (15%) si cea a genunchiului (15%). Distructiile si deformarile osoase constituie un semn tardiv de tuberculoza. Analiza prin tehnica PCR a lichidului sinovial constituie o metoda rapida de diagnostic al artritei genunchiului⁷.

Recomandari pentru determinarea Mycobacterium tuberculosis – ADN

• Detectarea rapida a complexului Mycobacterium tuberculosis ADN in diverse produse patologice.
• Diagnosticul tuberculozei in asociere cu izolarea M. tuberculosis in cultura⁶.

Pregatire pacient – nu este necesara⁵.

Specimen recoltat – a) probe recoltate din tractul respirator: sputa, lichid obtinut prin spalatura bronsica sau lavaj bronho-alveolar; b) o proba de urina spontana; c) lichid cefalorahidian recoltat prin punctie lombara; d) lichid de punctie (pleural, pericardic, ascita, sinovial)⁵.

Recipient de recoltare – eprubete pentru urina (sunt necesare 3 deoarece fiecare are 10 ml); recipient steril pentru restul probelor.

Cantitate recoltata – a) 3 mL; b) 30-50 mL; c) si d) minimum 2 mL.

Prelucrare necesara dupa recoltare – probele nu vor fi centrifugate.

Stabilitate proba -probele sunt stabile 48 h la 2-8°C.

Metoda – Real-time PCR TaqMan: reactie de polimerizare in lant cu detectie in timp real a produsului PCR  acumulat, prin masurarea fluorescentei emise (test calitativ)⁵.

Valori de referinta – Mycobacterium tuberculosis complex – ADN nedetectabil⁵.

Limita de detectie – 20 copii/proba⁵.

Interpretarea rezultatelor

Un rezultat pozitiv indica prezenta ADN-ului Mycobacterium tuberculosis in proba testata^5;6.

Rezultatele obtinute in cazul probelor recoltate din tractul respirator vor fi interpretate impreuna cu cele furnizate de examenul microscopic, astfel:

● Examen microscopic pozitiv si test PCR pozitiv: se va considera ca pacientul are tuberculoza si se va incepe tratamentul specific; vor fi asteptate oricum rezultatele la cultura pentru confirmarea definitiva a diagnosticului.

● Examen microscopic negativ si test PCR pozitiv: in functie de contextul clinic si celelalte investigatii medicul clinician va decide initierea terapiei tuberculostatice; daca este nevoie, va fi repetat testul PCR pe o noua proba; vor fi asteptate oricum rezultatele la cultura pentru stabilirea definitiva a diagnosticului.

● Examen microscopic pozitiv si test PCR negativ: daca testul PCR s-a validat corect (control intern in limitele acceptate) si s-au obtinut 2 rezultate negative pe 2 probe diferite, se poate presupune ca pacientul are o infectie cu mycobacterii non-tuberculoase; medicul clinician va decide initierea terapiei specifice in cazurile speciale in care suspiciunea clinica de tuberculoza este mare, chiar daca testul PCR a dat rezultate negative; vor fi asteptate oricum rezultatele la cultura pentru stabilirea definitiva a diagnosticului.

● Examen microscopic negativ si test PCR negativ:  diagnosticul de tuberculoza nu poate fi exclus in totalitate; medicul clinician va decide initierea terapiei specifice in cazurile speciale in care suspiciunea clinica de tuberculoza este mare, chiar daca examenul microscopic si testul PCR au dat rezultate negative; vor fi asteptate oricum rezultatele la cultura pentru stabilirea definitiva a diagnosticului³.

Limite si interferente

Sunt posibilele si situatiile in care nu se obtine validarea testului PCR (controlul intern nu este situat in limitele admise); acest fapt poate indica prezenta de inhibitori in produsele testate (3-7% din cazuri) care impiedica amplificarea ADN-ului. In acest caz testul PCR nu poate fi utilizat in elucidarea diagnosticului³. 

Acest test trebuie realizat impreuna cu culturile bacteriene.
Pentru un diagnostic corect, rezultatele testelor PCR trebuie corelate cu simptomele clinice prezente in momentul investigatiei.

Un rezultat negativ nu exclude prezenta Mycobacterium tuberculosis, deoarece bacilul poate fi prezent la nivele aflate sub limita de detectie a acestui test².

Nu a fost evaluata performanta testului PCR in cazul pacientilor la care s-a initiat deja tratamentul tuberculostatic^3;6.

Bibliografie

1. Babu S. Nagesh, Shobha Sehgal, Surinder K. Jindal and Sunil K. Arora. Evaluation of Polymerase Chain Reaction for Detection of Mycobacterium tuberculosis in Pleural Fluid. In Chest 2001; 119; 1737-1741.

2. Bongani M. Mayosi. Tuberculous Pericarditis. In Circulation. 2005;112:3608-3616.

3. CDC. Updated Guidelines for the Use of Nucleic Acid Amplification Tests in the Diagnosis of Tuberculosis, MMVR, Jan. 2009, 58(01), 7-10.

4. Chow KM; Chow VC; Hung LC; Wong SM; Szeto CC. Tuberculous peritonitis-associated mortality is high among patients waiting for the results of mycobacterial cultures of ascitic fluid samples. In Clin Infect Dis 2002 Aug 15;35(4):409-13. Epub 2002 Jul 17.

5. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2015. Ref Type: Catalog.

6. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: Mycobacterium tuberculosis Complex, Molecular Detection, PCR. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.

7. Nobukazu Fujimoto et al. Tuberculosis diagnosed by PCR analysis of synovial fluid. In Journal of Infection and Chemotherapy, vol.16. nr.1, febr.2010, 53-55.